Количественное определение колониеобразующих единиц кишечно-ассоциированных бактерий у мух дрозофил

Начните с микропланшета, содержащего гомогенаты, приготовленные из мух дрозофилы . Эти мухи содержали в своем кишечнике контролируемую популяцию определенной бактерии.

Гомогенаты содержат лизированные ткани мухи и высвобожденные кишечные бактерии.

Аспирируйте взвешенные бактерии и последовательно разбавляйте на нескольких микропланшетах.

Наносите небольшие объемы из каждого разбавления на агаровые пластины, следя за тем, чтобы капли оставались разделенными.

Инкубируйте, чтобы позволить бактериям размножаться в видимые колонии.

Сделайте снимки планшетов для количественного определения колониеобразующих единиц (КОЕ), которые представляют собой количество жизнеспособных бактериальных клеток, способных образовывать отдельные колонии.

Используя программное обеспечение для анализа изображений, выровняйте каждое изображение по опорной линии, определите границу и примените единую сетку, чтобы разделить его на зоны подсчета, каждая из которых соответствует одному пятну.

Отрегулируйте порог яркости, чтобы отличить отдельные колонии от фона, затем запустите анализ, чтобы подсчитать колонии в каждом месте и количественно определить КОЕ.

Поместите три прямоугольные пластины роста агара MRS с открытыми крышками в шкаф биобезопасности для сушки в течение не менее 10 минут. Приготовьте два планшета для разведения, добавив по 100 микролитров PBS в каждую лунку стерильного 96-луночного планшета с помощью 96-канального пипеттера. Загрузите штатив с наконечниками P-20 на 96-канальный пипеттер.

Сделайте разведение в соотношении 1:10, отасунув 11,1 микролитра гомогената из планшета для образца. Теперь выдавите его в первую разбавляющую пластину, содержащую 100 микролитров стерильного PBS на лунку. Держите пластину разбавления на шейкере в течение 10 секунд при 600 об/мин.

Перемешайте еще раз, делая пипетку вверх и вниз не менее 10 раз. Перелейте 11,1 микролитра с первой разбавляющей пластины на вторую разбавляющую пластину и повторите этапы смешивания для дальнейших разбавлений. Для определения выводящих жидкостей загрузите по два микролитра из каждой лунки в 96-канальный пипеттер.

Медленно опустите головку пипетки на пластину, избегая вонзания в агар, и убедитесь, что все пятна были удалены. Затем проверьте, чтобы пятна от жидкости быстро впитались в агар и не слипались. Повторите процесс нанесения покрытия для остальных разбавляющих пластин, как описано в рукописи.

Как только жидкость полностью впитается в агар, переверните пластины и инкубируйте их до тех пор, пока колонии не достигнут оптимального размера. Организуйте пластины логично и держите их в определенном порядке во время фотографирования. Сориентируйте их так, чтобы А1 находился в верхнем левом углу для всех пластин.

Сняв крышку тарелки, поставьте тарелку на сцену так, чтобы А1 был ориентирован в правильном углу. Представьте себе таблички. Перенесите изображения на компьютер и переименуйте их, указав название эксперимента, тип носителя, коэффициент разбавления и другие соответствующие детали.

Организуйте изображения, которые будут обработаны для количественной оценки, в папку. Имена файлов, которые отличают таблички, становятся заголовками столбцов для каждого набора счетчиков в выходной электронной таблице. Создайте в папке вложенные папки с именами «Обрезанные» и «Квитанции».

Эти папки будут получать выходные файлы. Теперь запустите плагин Croptacular из ImageJ и нажмите OK, чтобы начать обрезку. Появится диалоговое окно для выбора исходной папки.

Нажмите OK. Выберите исходную папку и нажмите кнопку Открыть. Затем нажмите OK в диалоговом окне для выбора каталога назначения. Выберите папку назначения и нажмите «Открыть».

Если изображение уже прямое, просто нажмите Пробел. В противном случае выпрямите изображение, проведя линию вдоль края, который должен стать горизонтальным. Перерисовывайте линию столько раз, сколько необходимо, если изображение не выглядит прямым.

Далее нарисуйте ограничительный прямоугольник для области подсчета и отрегулируйте его размер и пропорции до тех пор, пока все пятна не окажутся в своих ячейках. Перетащите курсор за пределы рамки границы, чтобы обновить сетку. Когда сетка будет выглядеть хорошо, нажмите клавишу Space.

Поскольку плагин предполагает, что все фотографии выровнены одинаково, убедитесь, что следующее изображение автоматически поворачивается на тот же угол, что и первое. Если это верно, нажмите Space, чтобы продолжить. В противном случае выпрямите изображение, как и раньше.

Сетка также напоминает то же положение, что и предыдущее изображение. При необходимости отрегулируйте и нажмите клавишу Space. Запустите Count-On-It и выберите Gridiron.

Установите пороговую интенсивность колонии на основе верхнего и нижнего значений интенсивности пикселей. Сделайте порог как можно более строгим, при этом отбирая все колонии. Нажмите OK в диалоговом окне Требуется действие, когда пороговое значение будет удовлетворительным, затем нажмите OK, чтобы продолжить.

На первом изображении предоставляется возможность продолжить или вернуться в меню настройки. Чтобы продолжить пакетный процесс, нажмите OK. Затем выберите папку для хранения чеков и таблицы результатов. Используйте созданную ранее папку «Квитанции».

После первого изображения следующие изображения по умолчанию будут иметь тот же порог, что и предыдущие настройки. Нажмите OK, чтобы использовать эти настройки или изменить их.