Обнаружение поверхностных транспортеров металла у Neisseria gonorrhoeae с помощью точечной блоттинга

Начните с культуры Neisseria gonorrhoeae , выращенной в среде, обедненной металлами.

Дефицит металла вызывает экспрессию внешних мембранных транспортеров, которые инициируют поглощение металла, когда он доступен.

Поместите предварительно смоченную нитроцеллюлозную мембрану на влажную фильтровальную бумагу и соберите аппарат для блот-блота.

Найдите бактериальные клетки и дайте жидкости впитаться.

Разберите аппарат, снимите мембрану и просушите его на воздухе.

Добавьте блокирующий агент для предотвращения неспецифической привязки.

Снова вставьте мембрану в аппарат, запечатайте его парапленкой и соберите заново.

Добавьте лиганд, связывающий металлы, полученный от хозяина, и инкубируйте с встряхиванием.

Лиганд связывается с бактериальными транспортерами.

Удалите жидкость и промойте мембрану, чтобы удалить несвязанный лиганд.

Добавьте лиганд-специфичное первичное антитело, за которым следует конъюгированное ферментом вторичное антитело и колориметрический реагент для детектирования, который образует окрашенный продукт.

Видимый сигнал указывает на экспрессию бактериальных металлических транспортеров в условиях ограниченного использования металлов.

После удвоения массы инкубации, обратно разбавляют к