Обнаружение поверхностных транспортеров металла у Neisseria gonorrhoeae с помощью точечной блоттинга

Начните с культуры Neisseria gonorrhoeae , выращенной в среде, обедненной металлами.

Дефицит металла вызывает экспрессию внешних мембранных транспортеров, которые инициируют поглощение металла, когда он доступен.

Поместите предварительно смоченную нитроцеллюлозную мембрану на влажную фильтровальную бумагу и соберите аппарат для блот-блота.

Найдите бактериальные клетки и дайте жидкости впитаться.

Разберите аппарат, снимите мембрану и просушите его на воздухе.

Добавьте блокирующий агент для предотвращения неспецифической привязки.

Снова вставьте мембрану в аппарат, запечатайте его парапленкой и соберите заново.

Добавьте лиганд, связывающий металлы, полученный от хозяина, и инкубируйте с встряхиванием.

Лиганд связывается с бактериальными транспортерами.

Удалите жидкость и промойте мембрану, чтобы удалить несвязанный лиганд.

Добавьте лиганд-специфичное первичное антитело, за которым следует конъюгированное ферментом вторичное антитело и колориметрический реагент для детектирования, который образует окрашенный продукт.

Видимый сигнал указывает на экспрессию бактериальных металлических транспортеров в условиях ограниченного использования металлов.

После удвоения массы инкубации, обратно разбавляют культуры тремя объемами ЦДМ. Затем инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение четырех часов. Незадолго до четырехчасовой отметки вырежьте три листа фильтровальной бумаги и кусок нитроцеллюлозы до приблизительного размера, необходимого для установки в аппарат для блот-блоттинга.

Предварительно замочите нитроцеллюлозу в деионизированной воде примерно на 10 минут перед сборкой аппарата с помощью фильтровальной бумаги ниже нитроцеллюлозы. В конце инкубации зарегистрируйте плотность клеток и стандартизируйте плотность до соответствующей конечной плотности. Затем пипетируйте клеточные культуры на нитроцеллюлозе.

Когда фильтровальная бумага впитает всю жидкость, разберите аппарат и дайте кляксе высохнуть. Заблокируйте нитроцеллюлозную мембрану на один час соответствующим блокирующим раствором и соберите аппарат для дот-блоттинга, заменив фильтровальную бумагу на парафиновую пленку, чтобы создать герметичное уплотнение под нитроцеллюлозой. Разбавьте представляющий интерес металлсвязывающий лиганд до 0,2 микромоляра в блокаторе и зондируйте клетки в течение одного часа с умеренным встряхиванием.

В конце инкубации откачайте жидкость с помощью вакуума, промойте кляксу и следуйте стандартным иммунологическим процедурам для выработки сигнала.