Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 2:51 мин. • October 30th, 2025
Начните с нетипизируемого штамма Haemophilus influenzae , патогена дыхательных путей человека.
Нанесите бактериальную культуру на богатую питательными веществами селективную среду и инкубируйте ее в условиях, обогащенныхCO2, чтобы имитировать среду дыхательных путей.
Во время инкубации бактерии утилизируют питательные вещества и размножаются, образуя колонии.
Переведите колонию в селективную жидкую среду и инкубируйте, чтобы стимулировать рост бактерий в жидкой культуре.
Переложите аликвоту в микроцентрифужную пробирку.
Центрифуга, чтобы отделить бактерии и избавиться от надосадочной жидкости.
Повторно суспендируйте бактерии в буфере, снова центрифугируйте для промывки и отделения бактерий и выбросьте остаточную средусодержащую надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте бактерии в буфере и разбавьте.
С помощью спектрофотометра измерьте оптическую плотность на длине волны 600 нм, чтобы оценить концентрацию бактерий.
Поместите разведенную бактериальную культуру на селективную среду и инкубируйте для формирования колоний.
Подсчитайте колонии, чтобы рассчитать колониеобразующие единицы для подготовки инокулята к будущему использованию.
Выложите NTHI на тарелку с шоколадным агаром. Инкубируйте тарелку вверх дном в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. На следующий день культивируйте бактерии в инфузионном бульоне для мозга и сердца.
Затем в микроцентрифужную пробирку добавьте один миллилитр бульона. Прижмите смесь до 4 000 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS. Повторите этот шаг стирки еще раз.
Далее разведите 100 микролитров ресуспендированного раствора в 900 микролитрах PBS и измерьте абсорбционную способность культуры на 600 нанометрах. Используйте эту информацию, чтобы скорректировать инокулятив до 20 миллионов КОЕ на миллилитр.
Далее определяют жизнеспособность и КОЕ инокулята. Вырастите от одного до десяти серийных разведений бульона на шоколадных агаровых тарелках и инкубируйте пластины в течение ночи.