Измерение частоты неправильной трансляции Mycobacterium smegmatis с помощью репортерной системы GFP/Luciferase

Возьмем культуру Mycobacterium smegmatis, содержащую индуцируемые гены GFP, и мутантную люциферазу, помеченную сигналом секреции.

Мутантный ген кодирует неактивную люциферазу, но естественная неправильная трансляция во время синтеза белка приводит к образованию активного фермента.

GFP служит внутренним контролем для нормализации экспрессии люциферазы.

Добавьте индуктор для инициации экспрессии генов, затем поместите культуру в многолуночный планшет.

Вводите в выбранные лунки возрастающие концентрации исследуемой молекулы. Инкубировать.

В контрольных условиях неправильная трансляция приводит к активной секреции люциферазы.

Если исследуемая молекула ингибирует неправильную трансляцию, активная секреция люциферазы снижается.

Перенесите аликвоты культуры на черную пластину и измерьте флуоресценцию GFP.

Центрифуга для гранулирования ячеек.

Перенесите надосадочную жидкость, содержащую секретируемую люциферазу, и добавьте субстрат, где активная люцифераза катализирует свое окисление, производя люминесценцию.

Измерьте люминесценцию и рассчитайте соотношение люцифераза/GFP; Более низкое соотношение указывает на уменьшение неправильной трансляции из-за исследуемой молекулы.

Для начала закиньте два миллилитра среды 7H9 бактериальным репортерным штаммом.

Встряхивайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух дней или до тех пор, пока внешний диаметр на 600 нанометрах не достигнет стационарной фазы.

Затем субкультуру в 50 миллилитров среды 7Н9 и выращивают до тех пор, пока ОД на 600 нанометров не достигнет поздней стационарной фазы. Перед тем, как вылить бактерии в 96-луночный планшет, добавьте АТХ в конечной концентрации 50 нанограмм на миллилитр и хорошо перемешайте.

Добавьте 100 микролитров на лунку в прозрачную 96-луночную пластину с круглым дном. Затем добавьте различные дозы Ksg в выбранные лунки, чтобы проверить его влияние на скорость неправильной трансляции. Добавьте 200 микролитров стерильной воды в краевые лунки пластины, чтобы ограничить испарение из лунок для проб.

Закройте пластину, встряхните и наведите образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16–20 часов. С помощью многоканальной пипетки возьмите по 80 микролитров из каждой лунки. Перенесите образцы на 96-луночный планшет с черным дном и измерьте сигнал GFP с помощью люминометра.

После измерения сигнала GFP центрифугируйте планшет при 3 220 умноженных на g в течение 10 минут. Затем перенесите 50 микролитров надосадочной жидкости в 96-луночный планшет с белым дном.

Затем добавьте 50 микролитров подложки Nluc в каждую лунку, хорошо перемешайте и измерьте люминесценцию с помощью люминометра. Наконец, определите отношение Nluc/GFP, разделив скорректированное значение люминесценции Nluc на флуоресценцию GFP.