JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 3:54 мин • October 30th, 2025
Начните с культуры цианобактерий, которые являются фотосинтезирующими бактериями.
Эти бактерии содержат богатые липидами капли пластоглобул и тилакоидные мембраны, которые представляют собой складчатые мембранные структуры, богатые фотосинтетическими пигментами.
Центрифугируйте культуру и выбросьте надосадочную жидкость, чтобы удалить внеклеточные полисахариды, произведенные бактериями. Промойте гранулу, затем снова суспендируйте ее в буфере.
Используйте гомогенизатор высокого давления для создания силы сдвига, которая разрушает клеточные стенки и мембраны.
Разрыв тилакоидных оболочек высвобождает фотосинтетические пигменты в лизат. Высвобождение пигмента вызывает изменение цвета, что указывает на разрушение клеток и высвобождение пластоглобул.
Загрузите лизат в центрифужные пробирки, затем добавьте раствор сахарозы для формирования градиента плотности.
Центрифуга для разделения ячеистых компонентов по плотности.
Тилакоид и другие более тяжелые компоненты находятся на дне, в то время как пластоглобулы низкой плотности плавают наверх в виде отдельной полосы.
Соберите фракцию пластоглобул и храните ее в виде замораживания для дальнейшего анализа.
Выращивают 50 миллилитров культуры синэхоцистиса вида PCC 6802 в среде BG11 в течение 7-10 дней до достижения стационарной фазы.
С помощью спектрофотометра отрегулируйте плотность ячейки до оптической плотности 2,0 на 750 нанометрах. Чтобы удалить полисахариды, центрифугируйте 50 миллилитров культуры и удалите надосадочную жидкость. Повторите промывку ячеек в 50 миллилитрах буфера А два раза.
Повторно суспендируйте промытую гранулу в 25 миллилитрах буфера А и разбейте ячейки с помощью французской напорной ячейки при давлении 1100 фунтов квадратных дюймов. Повторите процесс три раза в холодных условиях, пока лизированный цвет не изменится с зеленого на красно-сине-зеленый под белым светом. Удалите аликвоту клеточного гомогената и отложите ее для хранения в качестве репрезентативного общего образца клеток.
Распределите полученный гомогенат по восьми трехмиллилитровым ультрацентрифужным пробиркам, заполненным максимум до 2,5 миллилитров в каждой пробирке. Наложите на этот гомогенат 400 микролитров среднего R, создавая ступенчатый градиент. Тщательно сбалансируйте пробирки, добавив при необходимости дополнительную среду R перед центрифугированием пробирок.
Тилакоид и другие более тяжелые органеллы, включая любые полигидроксиалканоатные тела, демонстрируют образование гранул, в то время как пластоглобулы образуют желтую маслянистую подушечку на вершине градиента сахарозы или рядом с ней. Соберите полученную плавающую прокладку из сырых пластоглобул с помощью шприца и отсадите собранный урожай в двухмиллилитровую пробирку.
При необходимости соскребите пластоглобулы со стороны стенки ультрацентрифужной пробирки кончиком иглы. Либо продолжайте обработку цианобактериями, либо храните необработанные пластоглобулы при температуре минус 80 градусов Цельсия и очищайте их позже.