Количественная оценка полярности и динамики компонента системы секреции у Legionella pneumophila

Начнем с Legionella pneumophila, респираторного патогена, экспрессирующего флуоресцентно помеченный компонент системы секреции, необходимый для инфекции хозяина.

Чтобы количественно оценить полярность этих компонентов, получить флуоресцентные изображения и отрегулировать контраст для различения отдельных клеток.

Поместите прямоугольные области от клеточного полюса к цитоплазме для измерения градиентов флуоресценции.

Замаскируйте эти области, чтобы извлечь среднюю интенсивность и дисперсию, а затем рассчитайте оценки полярности как отношения дисперсии к средней интенсивности.

Высокие показатели полярности указывают на целенаправленное рекрутирование компонентов на полюсах бактерий.

Для динамических измерений сделайте два цейтраферных снимка и отрегулируйте контрастность, чтобы четко визуализировать ячейки.

Поместите квадратные области в центр клетки, чтобы измерить цитозольную флуоресценцию.

Маскируйте целые ячейки для коррекции фотообесцвечивания и определяйте области фона между ячейками для вычитания шума.

Экспортируйте все интенсивности и рассчитайте изменение флуоресценции с течением времени.

Повышенная интенсивность указывает на кластеризацию, в то время как пониженная интенсивность отражает динамическое перераспределение компонентов секреции внутри бактерий.

Чтобы количественно оценить полярность, отрегулируйте контрастность изображения так, чтобы бактерии были хорошо видны.

Затем увеличьте интересующую область и с помощью инструмента «Область» поместите прямоугольник размером 0,25 на 1,3 микрометра, начиная с полюса и продолжаясь в цитоплазму, убедившись, что прямоугольник остается в пределах бактериальных границ.

Отметьте не менее 200 бактерий и создайте маски с помощью кнопки «Область для маски» в меню анализа. Нажмите на статистику маски и выберите объект в области маски. Затем отметьте средние значения интенсивности и дисперсии в разделе «Особенности и интенсивность».

Экспортируйте данные в виде текстового файла и используйте приложение для работы с электронными таблицами для вычисления полярности каждой бактерии в качестве отношения между дисперсией и средней интенсивностью.

Чтобы количественно оценить динамику гибридных белков, откройте окно захвата изображения и отметьте замедленную съемку.

Введите два в поле Количество временных точек. Получите два последовательных изображения Legionella Pneumophila , экспрессирующей интересующий флуоресцентный белок.

Отрегулируйте контрастность изображения до тех пор, пока ячейки не станут четко видны. Затем с помощью инструмента «Область» поместите квадрат размером 0,25 на 0,25 микрометра в центр не менее 400 клеток.

Затем с помощью кнопки «Область для маски» в меню анализа создайте маску из интересующих квадратов. Создайте новую пустую маску и с помощью инструмента «Пиксели» отметьте всю площадь ячейки не менее чем из 25 случайных ячеек. Создайте еще одну маску и с помощью инструмента «Большая кисть» выделите области между ячейками.

Наконец, выберите статистику маски и убедитесь, что объект выбран в области маски для маски один. В разделе Функции и интенсивность выберите среднюю интенсивность. Экспортируйте данные и повторите процесс для маски 2. Для маски 3 выберите всю маску и экспортируйте среднюю интенсивность.