JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 2:03 мин • October 30th, 2025
Начните с посева Legionella pneumophila, патогенной бактерии.
Эти бактериальные клетки обладают системой секреции на своей мембране, которая необходима для инфекции хозяина.
Суспензируйте бактериальные клетки в стерильной воде для достижения необходимой плотности для визуализации с помощью криогенной электронной томографии (крио-ЭТ).
Добавьте наночастицы золота, которые служат опорными точками для выравнивания изображения при трехмерной реконструкции.
Возьмите сетку с перфорированной углеродной пленкой, чтобы отложить бактериальный образец.
Поместите решетку в заполненную газом камеру и подайте электрический разряд, чтобы сделать поверхность более гидрофильной.
Нанесите суспензию на сетку, дав жидкости равномерно распределиться по поверхности и ячейкам осесть.
Удалите лишнюю воду из сетки и погрузите ее в жидкую морозную среду, чтобы заморозить образец и сохранить его ячеистую архитектуру.
Теперь образец готов к крио-ЭТ-визуализации системы бактериальной секреции.
Чтобы подготовить образец для электронной криотомографии, вырастите толстое пятно Legionella Pneumophila на пластинах CYE-агара-стрептомицина в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия.
Ресуспендируйте клетки в воде с наружным диаметром600 около 0,7. Затем добавьте пять микролитров частиц коллоидного золота в 20 микролитров клеточной суспензии. Нагрейте дырчатой угольной сеткой и пипеткой пять микролитров клеточной смеси на ней.
Дайте постоять одну минуту. Промокните сетку фильтровальной бумагой и заморозьте ее в жидком этане с помощью плунжерного аппарата с гравитационным приводом.