Естественная трансформация и экспрессия GFP в нитчатой цианобактерии Phormidium lacuna

Возьмем культуру Phormidium lacuna, нитчатой цианобактерии.

Гомогенизируйте культуру для диспергирования нитей, затем центрифугируйте для гранулирования бактерий.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в среде, богатой питательными веществами.

Добавьте плазмидную ДНК, содержащую зеленый флуоресцентный белок и гены устойчивости к антибиотикам, на агаровую пластину с добавлением антибиотиков.

Добавьте бактериальную суспензию поверх ДНК и инкубируйте в световых условиях.

Бактерии интернализуют ДНК с помощью пилей IV типа. Введенные гены интегрируются в одну из множественных копий бактериального генома.

Перераспределите бактерии на агаровую пластину с антибиотиками, чтобы выбрать преобразованные бактерии.

Под световым микроскопом определите здоровые зеленые нити, указывающие на успешное преобразование.

Перенесите выбранные филаменты в жидкие среды с более высокой концентрацией антибиотиков, чтобы обогатить преобразованную популяцию.

Опять же, положите их на агар с более высоким уровнем антибиотиков для разделения трансформантов.

Визуализируйте экспрессию GFP под флуоресцентным микроскопом для подтверждения успешного преобразования.

Начните с введения 50 миллилитров жидкой среды F2 в каждую из двух 250-миллилитровых колб с одним миллилитром нитей P. lacuna из бегущей культуры. Выращивайте при белом свете при перемешивании около пяти дней при температуре 25 градусов по Цельсию.

Через пять дней гомогенизируйте 100 миллилитров суспензии клеток P. lacuna при 10 000 об/мин в течение трех минут и измерьте оптическую плотность на 750 нанометрах. Затем центрифугируйте клеточную суспензию в течение 15 минут при 6000-кратном избежении. Удалите надосадочную жидкость и суспензируйте гранулу в 800 микролитрах оставшейся жидкости и дополнительной среде F2+. Возьмите восемь агаровых пластин F2+ Bacto, содержащих 120 микрограммов канамицина на миллилитр, и задайте пипеткой 10 микрограммов ДНК в середину каждой агаровой пластины.

Немедленно пипеткой нанесите 100 микролитров клеточной суспензии поверх ДНК. Держите агаровую пластину без крышки на чистом скамейке, чтобы лишняя жидкость испарилась. Закройте тарелку и выращивайте ее в белом свете при температуре 25 градусов Цельсия в течение двух дней.

Через два дня распределите нити каждой агаровой пластины на несколько свежих агаровых пластин F2+ Bacto, содержащих 120 микрограммов на миллилитр канамицина с петлей инокуляции. Культивируйте пластины при белом свете при температуре 25 градусов Цельсия и регулярно проверяйте культуры под микроскопом. Через 14–28 дней определите мертвые коричневатые нити и ищите трансформированные нити под микроскопом.

Преобразованные нити выглядят здоровыми и зелеными и отличаются от основной массы нитей. Переложите каждую отдельную преобразованную нить в 50-миллилитровые колбы с 10 миллилитрами среды F2+ с 250 микрограммами на миллилитр канамицина. Культивируйте при белом свете при температуре 25 градусов Цельсия на шейкере и наблюдайте за ростом до четырех недель.

Перенесите нити обратно в агаровую среду, содержащую 250 микрограммов канамицина на миллилитр, и подождите, пока нити вырастут. Затем снова увеличьте концентрацию канамицина, чтобы ускорить сегрегацию. Для экспрессии GFP наблюдает за отдельными нитями с помощью флуоресцентного микроскопа при 40-кратном или 63-кратном увеличении и захватывает яркопольное изображение пропускания и флуоресцентное изображение.