Генерация меченых антибиотиками мутантов у цианобактерий путем гомологичной рекомбинации

Начните с культуры цианобактерий.

Центрифугируйте культуру, затем аккуратно промойте гранулы, чтобы сохранить бактериальную поверхность пили.

Снова центрифугуйте, повторно суспендируйте гранулу в свежей среде и переложите в пробирку.

Ввести нереплицирующийся вектор с геном устойчивости к антибиотикам. Этот ген окружен последовательностями ДНК, которые гомологичны областям, расположенным выше и ниже по течению от гена-мишени в бактериальном геноме.

Инкубируйте для обеспечения опосредованной пили интернализации плазмиды, которая выравнивается с гомологичными последовательностями и заменяет ген-мишень посредством рекомбинации, тем самым внося мутацию.

Распределите клетки по агару и инкубируйте, позволяя гену устойчивости к антибиотикам экспрессировать белок резистентности.

Обложите поверхность агара агаром, содержащим антибиотик, и инкубируйте. Белок резистентности в мутантных клетках инактивирует антибиотик, способствуя их выживанию и образованию колоний.

Соберите уцелевшие колонии и повторно используйте агар, содержащий антибиотик, чтобы отделить устойчивых к антибиотикам мутантов.

После приготовления сред, штаммов цианобактерий и плазмид, в соответствии с текстовым протоколом, создают свеж