Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 3:09 мин. • November 28th, 2025
Возьмём генетически модифицированную культуру E. coli , экспрессирующую массивӗ хромосомного оператора тетрациклина (teTO).
Бактерии также несут плазмиду с промотором, индуцируемым арабинозой, которая стимулирует экспрессию белка репрессора тетрациклина, помеченного YFP.
Переместить культуру в обогащённую питательную среду с антибиотиками и инкубировать с помощью встряхивания для отбора клеток, содержащих плазмиду.
По мере роста клеток формируются реплисомы и инициируют репликацию хромосомной ДНК.
На экспоненциальной фазе соберите часть как неиндуцированный контроль.
Добавьте арабинозу — индуктор — к оставшейся культуре и инкубируйте обе культуры с помощью встряхивания.
В неиндуцированной культуре димер AraC остаётся связанным с ДНК-петлей, подавляя экспрессию репрессоров.
В индуцированной культуре арабиноза связывается с димером AraC, вызывая экспрессию репрессоров.
Репрессорные белки связываются с хромосомным массивом teTO, останавливая прогрессию вилок репликации.
Используйте флуоресцентную микроскопию для наблюдения обеих культур.
Флуоресцентные очаги в индуцированной культуре E. coli подтверждают блокировку репликации, опосредованную белками репрессора.
Для этой процедуры используется штамм E. coli , несущий операторную решетку тетрациклина в плазмиде pKM1. pKM1 кодирует TetR-YFP — индуцируемый желтый флуоресцентный белок-репрессор тетрациклина.
Разведите свежую ночную культуру этого штамма E. coli до оптической плотности 600 нанометров 0,01 в разбавленной сложной среде с применением антибиотиков при необходимости отбора. Выращивайте культуру при 30 градусах Цельсия с встряхиванием до оптической плотности 600 нанометров от 0,05 до 0,1. Удалите образец объемом 10 миллилитров, чтобы он служил неиндуцированным контролем.
Добавьте 0,01% арабинозы в оставшуюся культуру для стимуляции образования TetR-YFP из pKM1. Продолжайте выращивать как неиндуцированные, так и индуцированные культуры при 30 градусах Цельсия с помощью встряхивания. Через час проверьте наличие одной фокусной точки в каждой клетке индуцированной культуры с помощью флуоресцентной микроскопии.
Если индуцированные клетки подтверждены блокировкой, что указывает более 70% клеток с одним фокусом, запишите оптическую плотность и удалите 7,5 миллилитра образца для анализа с помощью двумерного гелевого электрофореза. Удалите эквивалентный образец из неиндуцированной контрольной культуры.