JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 2:48 мин • November 28th, 2025
Возьмём мастер-смесь, содержащую ДНК-полимеразу, вытесняющую цепи, нуклеотиды и двухцепочечную ДНК-связывающую краситель для петле-опосредованной изотермической амплификации (LAMP).
Добавьте праймеры, содержащие обратно-комплементарную последовательность, специфичную для гена-мишени бактерий.
Распределите мастер-микс по трубкам.
Добавьте образцы с бактериальными ДНК-шаблонами в пробирки.
Поместите трубки внутрь прибора LAMP.
Начальная денатурация позволяет праймеру связываться с целевой ДНК.
Когда полимераза, вытесняющая цепь, начинает синтезировать новую цепь, она вытесняет существующую, устраняя необходимость в термическом цикле.
Усиленное произведение образует зацикленную структуру благодаря обратно-комплементарной паре.
Эта структура содержит несколько стартовых участков для следующего цикла, что способствует экспоненциальной амплификации целевой ДНК.
Краситель связывается с амплифицированной ДНК и излучает флуоресценцию.
Отслеживайте флуоресценцию в реальном времени, чтобы обнаружить наличие целевой бактериального гена в образцах.
Физически разделить области, используемые для подготовки мастер-микса LAMP и добавления ДНК-шаблонов.
Очистите рабочие поверхности изопропанолом и раствором для разложения ДНК и ДНКаз. Затем очистите пипетки и держатели для полосок трубок. Разморозить изотермальную мастер-смесь, 10-кратную праймерную смесь, молекулярную воду, положительную контрольную ДНК и шаблоны ДНК при комнатной температуре.
Включите прибор LAMP и введите соответствующую информацию о образце. Подготовьте LAMP Master Mix согласно рукописным инструкциям, проведите вихрь и кратковременно центрифугуйте его, а также распределите 23 микролитра Master Mix в каждую яме трубочной ленты. Вихрьте все шаблоны ДНК и кратковременно центрифугуйте их.
Затем добавьте два микролитра ДНК-шаблона в соответствующую скважину и плотно закройте его. Снимите ленту трубки из держателя и протяните её, чтобы убедиться, что все реагенты скопились на дне трубки. Загрузите ламповую ленту в прибор LAMP и запустите запуск LAMP.
Пока идёт реакция LAMP, нажмите на вкладки «Температура», «Усиление» и «Отгрев», чтобы увидеть динамические изменения различных параметров во время работы LAMP.