Подготовка образцов Myxococcus xanthus для изображения живых клеток

Начните с культуры Myxococcus xanthus — медленнорастущей почвенной бактерии.

Инокулировать колонию в среду с добавлением антибиотика.

Клетки были спроектированы так, чтобы сопротивляться антибиотику, обеспечивая выживание только желаемых бактерий.

Переложите суспензию в большую колбу с материалом и инкубуйте с помощью встряхивания, чтобы способствовать оптимальному росту.

Возьмите накладку, установленную на металлической раме, которая обеспечивает механическую поддержку при съёмке.

Нанесите бактериальную культуру на него, затем добавьте флуоресцентные микросферы, чтобы они служили точками отсчёта для выравнивания изображения при получении нескольких изображений.

Положите заранее подогретую агарозную подушечку с этим материалом, затем накройте её покрытием для поддержания увлажнения.

Инкубировать, чтобы клетки могли прилипнуть к агарозной подушечке.

Подушечка снабжает клетки питательными веществами, позволяя долгосрочно снимать живые клетки процессы во время пролиферации в медленнорастущей бактерии.

Для начала повторно суспензировать одну колонию M. xanthus в 500 микролитрах 1% CTT, с добавлением антибиотиков, в стерильную трубку и перенести всю суспензию в 50-миллилитровую колбу Эрленмайера, содержащую пять миллилитров 1% CTT. Приготовьте 1% агарозный микроскопический раствор, содержащий 0,2% КТТ, смешав один грамм агарозы с 80 миллилитрами буфера TPM и 20 миллилитрами среды 1% КТТ. Разогрейте раствор в микроволновке, пока агароза не расплавится.

Наполните чашку Петри примерно 60 миллилитрами расплавленной агарозы и дайте ей остыть до комнатной температуры. Предварительно разогрейте подушечку агарозы при 32 градусах Цельсия не менее 15 минут перед использованием. Далее наместите стерильную стеклянную накладку на пластиковую или металлическую раму с отверстием посередине. Затем используйте скотч, чтобы прикрепить накладку на раму.

Добавьте от 10 до 20 микролитров экспоненциально выращенных клеток M. xanthus на покрытие. Чтобы добавить флуоресцентные микросферы в качестве фидуциальных маркеров клеток, используйте буфер TPM, чтобы разбавить микросферы до 1:100. Тщательно встряхните подвеску шариков и добавьте от пяти до десяти микролитров в клетки.

Из большой, предварительно подогретой агарозной подушки с 1% вырезать небольшую подушечку примерно размером с покрытие и положить её сверху клеток. Затем наденьте крышку сверху на площадку, чтобы предотвратить испарение и поддерживать клетки в влажной среде. Инкубировать микроскопический образец при 32 градусах Цельсия в течение 15–20 минут, чтобы клетки прикрепились к дну агарозной площадки перед записями таймлапс-микроскопии.