Оценка защитной роли кислотно-активируемого шаперона при E. coli при кислотном стрессе

Возьмём культуры рекомбинантных E. coli , чувствительных к стрессу окружающей среды.

Тестовая культура содержит плазмиду, кодирующую кислотно-активируемый шаперон, а контрольная культура — только плазмидный хребет.

Инокуляция отдельных колоний в среду с добавлением антибиотиков для обеспечения удержания плазмид и инкубацию для стимулирования роста бактерий.

Разведите культуры в свежей среде с антибиотиком и индуктором для активации экспрессии шаперона.

Выращивайте культуры до средней логической фазы, затем разбавляйте для достижения определённой оптической плотности.

Добавьте кислоту для снижения pH, вызывая кислотный стресс.

В тестовой культуре кислотные условия активируют шаперон, который стабилизирует клеточные белки и препятствует их агрегации. В контрольной культуре отсутствие шаперона приводит к денатурации и агрегации клеточных белков.

Добавьте основание для нейтрализации pH и прекращения кислотного стресса.

Отслеживайте рост бактерий, измеряя оптическую плотность со временем.

Усиленный рост в тестовой культуре указывает на защитную роль сопровождающего во время кислотного стресса.

Подготовьте ночную культуру в 50 миллилитрах LB с Ампициллином и культивируйте клетки при 200 об/мин и 30 градусах Цельсия. Разбавьте ночные культуры в 40 раз до 25 миллилитров LB с Ампициллином.

Выращивать бактерии в присутствии 0,5% арабинозы при 30 градусах Цельсия и 200 об/мин до оптической плотности 600 нанометров или_{OD 600} , равной 1,0, чтобы индуцировать экспрессию белков HDEB. Для экспериментов с сдвигом pH используйте LB с ампициллином и арабинозой, чтобы разбавить клетки до_{OD 600} равного 0,5. Скорректируйте соответствующие значения pH, добавив соответствующие объёмы пяти молярной соляной кислоты.

После указанного времени нейтрализуйте культуры, добавляя соответствующие объемы пяти молярного гидроксида натрия. Мониторинг роста нейтрализованных культур и жидких культур в течение 12 часов при 30 градусах Цельсия с использованием измерений дозы.