Экстракция геномной ДНК на основе термического лизиса из патогенной бактерии

Начните с колоний патогенной бактерии, выращивающей на питательно богатой агарной среде.

Выберите одну колонию, которая обеспечивает генетически однородную популяцию бактериальных клеток и снижает вариабельность при генотипировании.

Используя стерильную инокуляционную петлю, переместите выбранную колонию в ультрачистую воду, чтобы минимизировать риск попадания загрязнителей в образец.

Вихрь суспензии, чтобы разрушить колонию и равномерно рассеять бактериальные клетки.

Далее нагрейте суспензию, чтобы разрушить оболочку бактериальной клетки, которая состоит из внешней мембраны, слоя пептидогликана и внутренней мембраны.

Это заставляет бактериальные клетки лизировать и высвобождать внутриклеточное содержимое, включая геномную ДНК, в воду.

Центрифугуйте суспензию на высокой скорости, чтобы отделить клеточный мусор от геномной ДНК.

Перенесите супернатант в новую трубку для последующей генотипизации.

Для начала используйте стерильные инокуляционные петли, чтобы высеять чистые культуры Yersinia ruckeri на любом подходящем типе агара на чашках Петри. Инкубировать при 22 градусах Цельсия в течение одного-двух дней или при 15 градусах Цельсия в течение трёх-четырёх дней. Затем, используя инокуляционные петли, выберите одну представительную колонию из каждой чашки Петри и переложите её в 1,5-миллилитровые центрифугные трубки, содержащие 50 микролитров ультраочищенной воды для повторного суспензия.

Вихрь кратко и инкубация в течение семи минут на нагревательном блоке при 100 градусах Цельсия. Затем центрифугуйте при 16 000 г в течение трёх минут и с помощью пипетки аккуратно переносите супернатантную шаблонную ДНК в пустые 1,5-миллилитровые центрифугные трубки. Переходите к следующему этапу или храните ДНК при минус 20 градусах Цельсия.