Обнаружение патогенов рыб с помощью анализа тандемных повторов с переменным числом (VNTR)

Начните с ПЦР-пластины, содержащей денатурирующий раствор на основе формамида.

В каждую скважину добавляют разбавленные ПЦР-ампликоны, полученные из патогенной бактерии рыб.

Эти ампликоны содержат флуоресцентно маркированные тандемные повторы с переменным числом (VNTR) — короткие повторяющиеся последовательности, используемые в качестве генетических маркеров для идентификации бактерий.

Запечатайте пластину и центрифугу для удаления воздушных пузырьков.

Нагрейте пластину в тепловом циклере для денатурации двухцепочечных VNTR.

Формамид усиливает разделение цепочек и подавляет повторный отжиг.

Быстро охлаждайте пластину, чтобы стабилизировать одноцепочечную ДНК.

Центрифуга для сбора объёма образца.

Снимите пломбу и закрепите пластину рамой.

Поставьте капиллярную трубку и проведите капиллярный электрофорез.

Во время электрофореза фрагменты VNTR мигрируют через капилляр под электрическим полем и разделяются по размеру.

Лазер возбуждает флуоресцентные метки на каждом фрагменте, создавая цветные сигналы.

Полученная электроферограмма показывает пиковые паттерны VNTR, соответствующие патогенной бактерии.

После подтверждения применения ПЦР-ампликонов используйте новые полоски или пластины для разведения продуктов ПЦР от 1 до 10 в очищенной воде. Вихрь и центрифуга на короткое время. Работая в шкафу с дымом, подготовьте мастер-смесь в центрифугной трубке, состоящей из формамида и стандартного раствора эталонного размера.

В зависимости от количества ПЦР-продуктов для анализа используйте объёмы реагентов, указанные в рукописи. Оставьте 10% запасного объёма. Кратковременно распределите 9,5 микролитра в отдельные скважины на ПЦР-пластине, подходящей для доступной системы капиллярного электрофореза.

Затем добавьте 0,5 микролитра разбавленного ПЦР-продукта. Запечатайте и ненадолго центрифугируете. Затем загрузите пластину с образцами в ПЦР-термоциклер и денатурируйте образцы при 95 градусах Цельсия в течение трёх минут, после чего остывайте до 4 градусов Цельсия бесконечно.

Центрифугите при 1000 г в течение одной минуты, аккуратно снимите уплотнение и загрузите пластину на калиброванную капиллярную электрофорезную систему согласно инструкциям производителя. Провести капиллярный электрофорез с анализом фрагментов, используя реагенты в зависимости от выбранного аппарата и скорректировать условия работы в соответствии с описанием в рукописи.