Обнаружение патогенов рыб с помощью анализа тандемных повторов с переменным числом (VNTR)

Начните с ПЦР-пластины, содержащей денатурирующий раствор на основе формамида.

В каждую скважину добавляют разбавленные ПЦР-ампликоны, полученные из патогенной бактерии рыб.

Эти ампликоны содержат флуоресцентно маркированные тандемные повторы с переменным числом (VNTR) — короткие повторяющиеся последовательности, используемые в качестве генетических маркеров для идентификации бактерий.

Запечатайте пластину и центрифугу для удаления воздушных пузырьков.

Нагрейте пластину в тепловом циклере для денатурации двухцепочечных VNTR.

Формамид усиливает разделение цепочек и подавляет повторный отжиг.

Быстро охлаждайте пластину, чтобы стабилизировать одноцепочечную ДНК.

Центрифуга для сбора объёма образца.

Снимите пломбу и закрепите пластину рамой.

Поставьте капиллярную трубку и проведите капиллярный электрофорез.

Во время электрофореза фрагменты VNTR мигрируют через капилляр под электрическим полем и разделяются по размеру.

Лазер возбуждает флуоресцентные метки на каждом фрагменте, создавая цветные сигналы.

Полученная электроферограмма показывает пиковые паттерны VNTR, соответствующие патогенной бактерии.

После подтверждения применения ПЦР-ампликонов используйте новые полоски или пластины для разведения