JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 3:01 мин • November 28th, 2025
Начните с ПЦР-пластины, содержащей денатурирующий раствор на основе формамида.
В каждую скважину добавляют разбавленные ПЦР-ампликоны, полученные из патогенной бактерии рыб.
Эти ампликоны содержат флуоресцентно маркированные тандемные повторы с переменным числом (VNTR) — короткие повторяющиеся последовательности, используемые в качестве генетических маркеров для идентификации бактерий.
Запечатайте пластину и центрифугу для удаления воздушных пузырьков.
Нагрейте пластину в тепловом циклере для денатурации двухцепочечных VNTR.
Формамид усиливает разделение цепочек и подавляет повторный отжиг.
Быстро охлаждайте пластину, чтобы стабилизировать одноцепочечную ДНК.
Центрифуга для сбора объёма образца.
Снимите пломбу и закрепите пластину рамой.
Поставьте капиллярную трубку и проведите капиллярный электрофорез.
Во время электрофореза фрагменты VNTR мигрируют через капилляр под электрическим полем и разделяются по размеру.
Лазер возбуждает флуоресцентные метки на каждом фрагменте, создавая цветные сигналы.
Полученная электроферограмма показывает пиковые паттерны VNTR, соответствующие патогенной бактерии.
После подтверждения применения ПЦР-ампликонов используйте новые полоски или пластины для разведения продуктов ПЦР от 1 до 10 в очищенной воде. Вихрь и центрифуга на короткое время. Работая в шкафу с дымом, подготовьте мастер-смесь в центрифугной трубке, состоящей из формамида и стандартного раствора эталонного размера.
В зависимости от количества ПЦР-продуктов для анализа используйте объёмы реагентов, указанные в рукописи. Оставьте 10% запасного объёма. Кратковременно распределите 9,5 микролитра в отдельные скважины на ПЦР-пластине, подходящей для доступной системы капиллярного электрофореза.
Затем добавьте 0,5 микролитра разбавленного ПЦР-продукта. Запечатайте и ненадолго центрифугируете. Затем загрузите пластину с образцами в ПЦР-термоциклер и денатурируйте образцы при 95 градусах Цельсия в течение трёх минут, после чего остывайте до 4 градусов Цельсия бесконечно.
Центрифугите при 1000 г в течение одной минуты, аккуратно снимите уплотнение и загрузите пластину на калиброванную капиллярную электрофорезную систему согласно инструкциям производителя. Провести капиллярный электрофорез с анализом фрагментов, используя реагенты в зависимости от выбранного аппарата и скорректировать условия работы в соответствии с описанием в рукописи.
В данной статье подробно описан метод анализа вариабельного числа тандемных повторов (VNTR) в ПЦР-ампликонах, полученных из патогенных для рыб бактерий. Процесс включает в себя капиллярный электрофорез для разделения и идентификации этих генетических маркеров.
Мультилокусный анализ коротких вариабельных тандемных повторов (VNTR) с использованием капиллярного электрофореза позволяет проводить точное генетическое профилирование бактерий, патогенных для рыб, что способствует идентификации патогенов на ранних стадиях и оценке рисков в биофармацевтических исследованиях и разработках. Данный рабочий процесс повышает прогностическую достоверность при отслеживании источников микробиологического заражения и служит основой для принятия решений по формированию портфеля вакцин или терапевтических средств, направленных против водных патогенов. Воспроизводимость метода и количественные результаты делают его надежным инструментом для трансляционных исследований и разработки аналитических систем.
Анализ VNTR методом капиллярного электрофореза интегрируется в процесс от поиска мишени до доклинических исследований, обеспечивая возможность генетического дактилирования для валидации микробных мишеней и подготовки анализа.
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026