Извлечение геномной ДНК из тканей листьев растений, инфицированных патогенными бактериями

Возьмите лист, инфицированный патогенной бактерией Candidatus liberibacter .

Разрежьте её на куски, быстро заморозьте в жидком азоте и измельчите, чтобы разорвать клетки растения и выпустить их содержимое, включая бактерии.

Добавьте буфер для лизиса ядер и тщательно перемешайте.

Инкубировать при высокой температуре для лизирования мембран, высвобождая геномную ДНК из ядер растений и бактериальных клеток.

Добавьте фермент РНазы, инвертируйте трубку для смешивания и инкубируйте для деградации РНК.

Добавьте раствор для осаждения белка и смешайте для стимулирования агрегации белка. Центрифуга в пеллетный белок и клеточный мусор.

Перенесите супернатант в трубку с изопропанолом и смешайте ДНК в видимые цепи. Центрифуга для гранулирования ДНК.

Промыйте гранулы этанолом, чтобы удалить примеси, высушить на воздухе и увлажнить ДНК.

Инкубировать при высокой температуре для растворения ДНК, затем загрузить образец в микрокювет.

С помощью спектрофотометра измерьте изолированную концентрацию ДНК.

Сначала используйте чистые ножницы, чтобы отрезать целый свежий лист цитрусового дерева и положить его в чистый пластиковый пакет для сэндвичей. Затем охладите ступку с пестиком, добавив небольшое количество жидкого азота. Затем ножницами нарежьте небольшие кусочки ткани листьев, примерно один квадратный дюйм.

Положите кусочки листьев в ступку, чтобы сразу их заморозить. Быстро начинайте измельчивать ткань листьев в ступке, пока жидкий азот не испарится, и не останется мелкий зелёный порошок. Затем охладите металлическую лопатку в жидком азоте на 10–15 секунд. Затем используйте холодную лопатку, чтобы зачерпнуть молотую ткань из раствора в микроцентрифугной трубке объёмом 1,5 миллилитра.

Используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы добавить 600 микролитров раствора лизиса ядер в образец. Затем проведите вихрь образца в течение одной-трёх секунд. Инкубировать трубку при 65 градусах Цельсия в водяной бане в течение 15 минут.

После окончания инкубационного периода используйте пипетку объемом 10 микролитров, чтобы добавить 3 микролитра раствора РНазы в лизат для удаления РНК. Затем смешайте содержимое трубки, перевернув её два-пять раз.

Инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут в шкаф-инкубаторе. Через 15 минут добавьте в образец 200 микролитров раствора белка для осадки. Закрутите трубку на высокой скорости на 20 секунд. Затем центрифугуйте образец при 13000 г в течение трёх минут.

Во время центрифугирования добавьте 600 микролитров изопропанола, поддерживаемого при комнатной температуре, в новую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра. После завершения центрифугирования аккуратно вынимите супернатант из трубки центрифуги в трубку с изопропанолом. Выбросьте шарики.

Инвертируйте трубку, чтобы ДНК была видна, как ниточная нить. Затем центрифугуйте образец при 13000 г в течение минуты при комнатной температуре.

Декантировать супернатант после центрифугирования. Затем добавьте 600 микролитров этанола 70% в гранулу. Переверните трубку несколько раз, чтобы промыть гранулы.

Центрифугуйте трубку при 13000 г на одну минуту. После завершения центрифугирования аккуратно аспирируйте супернатант. Затем переверните тюбик с открытой крышкой на впитывающей бумаге, чтобы она высохла на воздухе 15 минут.

После высыхания добавьте 100 микролитров раствора для регидратации ДНК в гранулу. Инкубировать суспензию ДНК при 65 градусах Цельсия в водяной бане в течение часа. Периодически постукивайте по трубке во время сведения.

Добавьте 1 микролитр очищенной воды в микро-кювет. На спектрофотометре показаны пустые показатели воды. Затем добавьте 1 микролитр образца в микрокювет. Положите микрокювету на спектрофотометр и измерите концентрацию ДНК.