Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии
7 ноября 2010 г.
Этот протокол описывает быстрый метод количественного транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану клеток методом проточной цитометрии.
Общая цель данной процедуры — обнаружить транслокацию GLUT4 к плазматической мембране клеток млекопитающих в ответ на воздействие инсулина. Миобласты, подвергнутые сывороточному голоданию и содержащие белок GLUT4 только внутри везикул, сначала высевают в 24-луночный культуральный планшет. Затем к клеткам добавляют антитела к внешнему эпитопу GLUT4, предварительно инкубированные с конъюгированным с флуорофором вторичным антителом, после чего добавляют инсулин.
Стимуляция инсулиновых рецепторов на поверхности клеток приводит к транслокации GLUT4 к плазматической мембране. Затем GLUT4 распознается антителами, находящимися в среде. После этого клетки можно зафиксировать и измерить интенсивность флуоресцентного окрашивания методом проточной цитометрии.
Данный метод может быть использован для изучения транслокации GLUT4 и метаболизма глюкозы, а также применим к другим системам, таким как дегрануляция NK-клеток посредством экспрессии CD107A на мембране. Для данной процедуры важно использовать активно растущие клетки с конфлюэнтностью 60–80%, подвергнутые сывороточному голоданию в течение ночи. После сбора клеток с помощью трипсина промойте и ресуспендируйте их в стандартной ростовой среде из расчета 200 000 клеток на миллилитр; распределите клетки по 24-луночному планшету в концентрации 0,1 млн на 500 µL на лунку. Затем инкубируйте клетки в течение одного часа при 37 °C для восстановления после воздействия трипсина.
Тем временем смешайте первичные антитела к glute four и конъюгированные с Alexa Fluor 4 8 8 вторичные антитела к IgG курицы в соотношении пять к одному; рассчитайте необходимый конечный объем, исходя из того, что на каждую лунку потребуется 10 µL смеси антител. Инкубируйте смесь антител в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Пока смесь антител инкубируется, приготовьте двухкратный рабочий раствор инсулина, разбавив его до нужной концентрации в ростовой среде.
После инкубации клеток в течение одного часа извлеките их из инкубатора. Осторожно добавьте по 10 µL раствора антител в каждую лунку с клетками. Обязательно оставьте хотя бы одну лунку неокрашенной.
Этот отрицательный образец будет использован позже для настройки проточного цитометра. Затем добавьте по 500 µL 2-кратного стокового раствора инсулина в каждую лунку, чтобы инициировать транслокацию GLUT4 на поверхность клеток, и инкубируйте планшет в течение 30 минут при 37 °C в темноте. После извлечения клеток из инкубатора зафиксируйте их, добавив по 1 мл PBS с 1% PFA в каждую лунку, и инкубируйте планшет в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте; с помощью клеточного скрейпера осторожно отделите зафиксированные клетки от дна лунок и перенесите их из каждой лунки в отдельную пробирку для FACS.
Центрифугируйте пробирки для осаждения клеток, затем перемешайте их на вортексе и ресуспендируйте в 1 mL PBS; повторите промывку и центрифугирование еще раз. Повторите процедуру промывки дважды, сливая супернатант между промывками.
В завершение ресуспендируйте промытые клетки в 400 µL PBS с 1% PFA. Теперь клетки можно проанализировать на экспрессию glute four на поверхности с помощью проточного цитометра. После доставки образцов к цитометру начните сбор данных с неокрашенного контроля.
Определите широкий гейт живых клеток, используя параметры прямого и бокового светорассеяния. Затем настройте напряжение для канала FL 1 так, чтобы отрицательный пик был виден в пределах границ гистограммы. После установки этих параметров проведите анализ каждого экспериментального образца, регистрируя не менее 10 000 живых событий на пробирку.
На этой гистограмме показано повышение экспрессии GLUT4 на поверхности мембраны при окрашивании миобластов, подвергнутых воздействию 0, 1, 10 или 100 нМ инсулина. Напротив, в миобластах людей с инсулинорезистентностью не наблюдается повышения экспрессии GLUT4 в ответ на 100 нМ инсулина. Если нормализовать среднюю интенсивность флуоресценции стимулированных клеток относительно нестимулированных, можно будет напрямую сравнить значения MFI для здоровых миобластов и миобластов с инсулинорезистентностью.
С помощью данной процедуры можно окрашивать клетки на дополнительные поверхностные или внутриклеточные маркеры для идентификации различных подмножеств клеток в смешанных популяциях.
Обзор
В данном протоколе описан экспресс-метод количественного определения транслокации GLUT4 из цитоплазмы к плазматической мембране клеток с помощью проточной цитометрии. Этот метод позволяет регистрировать транслокацию GLUT4 в ответ на воздействие инсулина в клетках млекопитающих.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Метаболизм
- Проточная цитометрия
Введение
- GLUT4 — это транспортер глюкозы, который перемещается к плазматической мембране в ответ на инсулин.
- Понимание механизмов транслокации GLUT4 имеет решающее значение для изучения метаболизма глюкозы.
- Данный метод также может быть применен к другим клеточным процессам, таким как дегрануляция NK-клеток.
- Сывороточное голодание необходимо для обеспечения точного измерения транслокации GLUT4.
Цель исследования
- Количественно оценить транслокацию GLUT4 на плазматическую мембрану.
- Проанализировать влияние инсулина на локализацию GLUT4 в миобластах.
- Представить протокол, который может быть адаптирован для других клеточных исследований.
Используемые методы
- Миобласты, подвергнутые сывороточному голоданию, высевают в 24-луночный планшет.
- Для маркировки клеток используют антитела к GLUT4.
- Добавляют инсулин для инициации транслокации GLUT4.
- Для измерения интенсивности флуоресцентного окрашивания применяют проточную цитометрию.
Основные результаты
- Воздействие инсулина приводит к значительной транслокации GLUT4 на поверхность клетки.
- В инсулинорезистентных миобластах наблюдается нарушение ап-регуляции GLUT4.
- Интенсивность флуоресценции может быть использована для сравнения здоровых и инсулинорезистентных клеток.
- Данный метод позволяет проводить дополнительное окрашивание поверхностных или внутриклеточных маркеров.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно количественно оценить транслокацию GLUT4 в ответ на воздействие инсулина.
- Его можно адаптировать для различных клеточных исследований, помимо изучения метаболизма глюкозы.
- Понимание динамики GLUT4 может дать ценную информацию о метаболических нарушениях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественное определение транслокации GLUT4 обеспечивает прямой функциональный показатель эффективности инсулинового сигналинга в моделях метаболических заболеваний. Данный метод анализа на основе проточной цитометрии позволяет проводить быструю количественную оценку взаимодействия с мишенью и активации сигнального пути в инсулиночувствительных клетках. Он способствует валидации мишеней на ранних стадиях и снижению механистических рисков при разработке терапевтических средств для лечения диабета и ожирения, связывая молекулярное воздействие с физиологическими механизмами поглощения глюкозы.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Измерение функциональной транслокации GLUT4 для подтверждения активации сигнального пути инсулинового рецептора в клетках млекопитающих.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность высокопроизводительного скрининга соединений или генетических возмущений, влияющих на экспрессию GLUT4, стимулируемую инсулином.
- Прогностическая ценность: Нормализованная средняя интенсивность флуоресценции позволяет проводить прямое сравнение здоровых фенотипов и фенотипов с инсулинорезистентностью для определения приоритетных мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Протокол занимает менее 4 часов и рассчитан на количество клеток от 3 000 до 1 миллиона на каждое условие для масштабируемого скрининга.
- Количественный результат: Проточная цитометрия обеспечивает точное измерение интенсивности флуоресценции, коррелирующее с уровнями GLUT4 на поверхности.
- Воспроизводимость: Включает неокрашенный контроль для стандартизации прибора и обеспечения согласованности гейтирования между экспериментами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболевания: Прямое моделирование инсулинорезистентности при диабете 2-го типа путем сравнения транслокации GLUT4 в здоровых и резистентных миобластах.
- Механистическое снижение рисков: Подтверждение того, восстанавливают ли исследуемые соединения инсулин-стимулируемую транслокацию в резистентных клетках.
- Трансляционная преемственность: Обеспечение перехода от поиска мишени к доклинической валидации путем установления связи между молекулярным действием и функцией транспорта глюкозы.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум от поиска до доклинических исследований, позволяя оценивать модуляторы инсулинового пути, начиная с подтверждения мишени и заканчивая функциональной валидацией на моделях метаболических заболеваний.
- Поисковая биология: Проверка гипотезы о том, что соединение усиливает инсулин-зависимую транслокацию GLUT4 в качестве механизма действия.
- Скрининг: Обеспечивает количественные результаты, совместимые с проточной цитометрией, что подходит для скрининга библиотек соединений в системах адгезивных клеток.
- Аналитика: Нормализованные соотношения MFI обеспечивают статистическую сопоставимость условий для отбора хитов и профилирования зависимости «доза-эффект».
- Трансляционные исследования: Связь модуляции мишени с физиологией поглощения глюкозы, что помогает в принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки в программах по изучению метаболических заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Возможность адаптации к другим событиям транслокации (например, дегрануляции NK-клеток через CD107a), что расширяет полезность платформы в области иммунометаболизма и иммуноонкологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает понимание механизмов модуляции инсулинового пути путем количественного определения ключевого нижележащего эффектора инсулинового сигналинга.
- Практическая ценность: стандартизированный, совместимый с фиксацией рабочий процесс позволяет проводить серийную обработку и обеспечивает воспроизводимость результатов между разными лабораториями.
- Стратегическая ценность: снижает количество ложноположительных результатов, требуя функционального подтверждения транслокации помимо анализов на связывание или фосфорилирование.
- Влияние на портфель разработок: позволяет принимать обоснованные решения о продвижении проектов с учетом рисков, подтверждая взаимодействие с мишенью в физиологически релевантном анализе транспорта глюкозы.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, методами проточной цитометрии и иммунофлуоресценции.
- Зависит от наличия проточного цитометра с флуоресцентным детектором (например, каналом FITC) и надлежащего контроля компенсации.
- Необходимы стандартизированные протоколы сывороточного голодания и стимуляции инсулином во всех пользовательских центрах.
- Адаптация метода для первичных клеток или альтернативных моделей может потребовать оптимизации условий фиксации и доступности антител.
- Метод ограничен эпитопами на поверхности клеток; без пермеабилизации невозможно определить внутриклеточные пулы или общий уровень экспрессии белка.
