Непрерывный мониторинг биологического шума у бактерий с помощью таймлапс-микроскопии

Начните с культивирующей пластины с бактериями, встроенными под агарозной гелевой подушечкой, чтобы обездвижить бактерии и поддерживать рост монослой.

Бактерии регулярно экспрессируют зелёный флуоресцентный белок, что позволяет отслеживать экспрессию генов в реальном времени.

Налейте дополнительный агрозный гель вокруг прокладки, чтобы запечатать образец, и дайте ему затвердеть при комнатной температуре.

Запечатайте пластину скотчем, перфорируйте её для газообмена и переверните, чтобы предотвратить конденсация.

Инкубировать пластину при низкой температуре для стабилизации геля и предотвращения бактериального деления.

Затем нанесите иммерсионное масло на объектив и установите пластину на стадию конфокального микроскопа.

Инициируйте таймлапс-визуализацию.

По мере постепенного созревания GFP он начинает флуоресценцию. Во время деления клеток эти флуоресцентные белки распределяются между дочерними клетками, вызывая снижение интенсивности флуоресценции.

Это создаёт пилозубчатый флуоресцентный паттерн, и различия в этом паттерне между генетически идентичными клетками в одной среде свидетельствуют о биологическом шуме в экспрессии генов.

Для получения изображения образцов вынимите колбу из воды и дайте гелю остыть до температуры тела. Вылейте три миллиметра геля по периметру пластины образца. Когда агароза затвердеет, запечатайте пластину лентой и используйте иглу 25 калибра, чтобы проколоть несколько отверстий в ленте.

Затем поставьте пластину вверх ногами при температуре 4 градусов Цельсия не менее 30 минут, чтобы агароза полностью затвердела и при этом предотвратил митоз клеток. В течение 24 часов используйте флуоресцентный конфокальный микроскоп, чтобы определить образец при минимальном увеличении и включить автоматическую систему фокусировки микроскопа. Нанесите масло на соответствующую цель и используйте контроллер платформы, чтобы аккуратно распределить масло.

Затем снова включить автоматическую фокусировку и следовать стандартному предложению по Z-шаговым сечениям для изображения сэмпла.