Обнаружение экспрессии целевых ферментов в генетически модифицированных бактериальных клетках

Начните с трубок с генетически модифицированными бактериальными клетками. Каждая бактерия содержит высококопируемые фосмиды, которые кодируют различные ферменты.

Инкубировать трубки с помощью встряхивания для облегчения экспрессии различных внутриклеточных ферментов.

Добавьте субстрат, специфичный для целевого фермента, в пробирку и равный объём буфера в контрольную трубку.

Инкубировать с помощью встряхивания. Субстрат проникает в клетки, где целевые ферменты его расщепляют, образуя флуоресцентный продукт.

Загрузите управляющую трубку в заранее откалиброванный потоковый цитометр.

Когда каждая ячейка проходит через лазерный луч, она рассеивает свет. Сгенерируйте график рассеяния для идентификации отдельных ячеек, которые рассеивают меньше света, чем скопления.

Исключить сгустки клеток и построить сигнал флуоресценции отдельных клеток для установления базовой флуоресценции.

Поместите обработанную субстратом трубку в потоковый цитометр для измерения флуоресцентного сигнала.

Повышенный сигнал флуоресценции в клетках, обработанных субстратом, по сравнению с контрольными клетками подтверждает экспрессию целевых ферментов.

Для скрининга интересующих метагеномных ферментов инкубировать отсортированные клетки при 37 градусах Цельсия и 200 об/мин до уровня_{OD 600} до 0,5. Затем добавьте 1 микролитр раствора для индукционной копии, чтобы усилить количество внутриклеточной копии фосмид.

Через три часа при 37 градусах Цельсия и при 250 об/мин соедините 0,5 миллилитра клеток с соответствующим субстратом в 14-миллилитровой трубке с круглым дном до конечной концентрации 100 микромоляров. Затем инкубировать контрольные и экспериментальные образцы при 37 градусах Цельсия и 200 об/мин ещё три часа.

Пока образцы дрожат, настройте параметры машины FACS, как только что показано. Затем добавьте 5 микролитров клеток из каждого образца в отдельные 5-миллилитровые пробирки с круглым дном с 1 миллилитром PBS. Далее загрузите ячейки выборки и установите скорость событий на 1000–3000 событий в секунду.

Создайте логарифм-масштабированную область прямого рассеяния и логарифмично-масштабированную боковую область рассеяния и скорректируйте элемент рассеяния R1, чтобы охватить бактериальные клетки синглетного события. Затем создайте график рассеяния с логарифмическим масштабированием прямого рассеяния против логарифм-масштабируемого FITC и установите сортировочный элемент R2 так, чтобы было обнаружено менее 0,1% отрицательных ячеек. Теперь загрузите пробирку и регулируйте частоту событий до 1000–3000 событий в секунду по мере необходимости.