Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 4:19 мин. • February 2nd, 2026
Возьмите посевную пластину с личинками Caenorhabditis , содержащими интересующие бактерии, колонизирующие их кишечный просвет.
В пластине содержится известный бактериальный штамм — пища. Морьте червей голодом, чтобы они съели все бактерии и вошли в состояние покоя.
Добавьте среду и перенесите червей в трубку.
Центрифугой и отбрось супернатант.
Добавьте раствор моющего средства, перемешивайте, чтобы удалить прилипшие к поверхности бактерии, снова центрифугуйте и выбросьте супернатант.
Повторите промывку, затем перенесите червей на свежую тарелку для культуры.
Позвольте ползанию удалить слабо связанные пищевые бактерии с поверхности и просвета кишечника, сохраняя при этом интересующие бактерии, которые стабильно колонизируют кишечник.
Повторите этап переноса и ползания, чтобы полностью удалить пищевые бактерии.
Добавьте среду, перенесите червей в стекло для часов и вскрытьте, чтобы обнажить их кишечник.
Вскрытие кишечника, содержащего интересующие бактерии, соберите их в водоносные трубки и заморозьте для дальнейшего использования.
Для голодания червей и уменьшения количества бактерий OP50-1 инкубировать нематод при 20 градусах Цельсия в течение трёх-четырёх дней. Добавьте 5 миллилитров среды M9 в пластину недавно изголодавших червей, затем перенесите M9 среду и червей в стерильную 15-миллиметровую центрифужную трубку, чтобы она опустилась при 1000 g в течение 30 секунд при комнатной температуре.
Перед промывкой червей удалите супернатант пятью разами с помощью 10 миллилитров M9 с 0,05% Triton X-100 на Nutator в течение 20 минут. После последней промывки удалите супернатант, не трогая гранулу в 100 микролитрах раствора, и перенесите M9 и червей на незасеянную 6-сантиметровую пластину NGM. Дайте тарелке высохнуть, пока черви ползут 20 минут, чтобы помочь удалить OP50-1 из кутикулы и кишечника.
Когда пластина высохнет, повторите процедуру: добавьте 250 микролитров M9 и переместите червей на новую незасеянную пластину NGM диаметром 6 сантиметров, чтобы черви могли ползать, пока пластина высыхает.
Через 20 минут добавьте 250 микролитров M9 на пластину и перенесите 100 микролитров M9 вместе с червями на чистое стекло часов.
Затем обезглавлите нематод иглой шприца 26-го калибра, удерживая червя другой иглой 26-го калибра.
После обезглавливания кишечник, гранулированная маса и прозрачная гонада естественным образом отклоняются от тела нематоды, затем отрезают часть открытого кишечника и перемещают один вскрытый кишечник в 0,5-миллилитровую ПЦР-трубку с 10 микролитрами стерильной воды. Повторите процедуру, чтобы собрать кишечник как минимум пяти разных животных в ПЦР-пробирках.
Заморозьте ПЦР-трубки при минус 80 градусах Цельсия минимум на 5 минут. Разморозьте образцы кишечника перед проведением ПЦР и секвенирования для идентификации.