Ультрацентрифугированная изоляция наружных мембранных пузырьков Legionella pneumophila

Начните с культуры Legionella pneumophila — патогенной грамотрицательной бактерии, которая выделяет внешние мембранные пузырьки.

Эти OMV содержат липополисахариды и мембранные белки, способствующие вирулентности бактерий.

Центрифугуйте культуру, чтобы бактерии были целыми гранулами.

Соберите супернатант, содержащий OMV, и снова центрифугуйте для гранулирования остаточных бактерий.

Фильтруйте супернатант через мембрану, чтобы удалить оставшиеся бактерии при сохранении ОМВ.

Проведите вторую фильтрацию с помощью свежей мембраны для удаления бактериальных остатков.

Соберите фильтрат, свободный от бактерий, и ультрацентрифугайте его, чтобы пеллетировать OMV.

Сбросьте супернатант, снова суспензируйте гранулу в буфере и снова ультрацентрифуга, чтобы удалить слабо связанные белки и липополисахариды.

Удалите супернатант и снова подвесьте очищенные OMV в буфере.

Разведите аликвот OMV на кровавые агар и BCYE агаровые пластины и инкубируетесь.

Отсутствие формирования колоний подтверждает отсутствие бактериального загрязнения.

Храните OMV при низкой температуре для исследований взаимодействия хозяина и патогена.

Оставшуюся жидкую культуру добавьте в 90 миллилитров свежей среды YEB и инкубируйте культуру на вращающем шейкере до достижения_{OD 600} при 3,0–3,5. Центрифугуйте жидкую культуру при 4 000 г в течение 20 минут, чтобы пеллетировать бактерии. Затем переведите супернатант в свежие центрифугные трубки.

Отбросьте бактериальные гранулы и снова центрифугайте образцы, прежде чем повторить этап центрифуга. Далее дважды простерилизуйте оставшийся супернатант.

Затем переместить супернатант без бактерий в ультрацентрифугные пробирки и вращать образцы при 100 000 г при 4 градусах Цельсия в течение 3 часов. Декантируйте супернатант и выбросьте его. Затем используйте стерильный PBS, чтобы подвесить OMV-гранулы и объединить их.

Повторите этап ультрацентрифугирования, чтобы удалить загрязняющие белки и освободить LPS. Теперь отбросьте супернатант и высушите ультрацентрифугную трубку стерильной ватной палочкой. Суспензируйте пеллету OMV с помощью 500 микролитров стерильного PBS.

Затем нанесите по 20 микролитров на пластины агара крови и BCYE, чтобы исключить бактериальное загрязнение подготовленного пузырька. Инкубировать пластину кровяного агара на ночь, а пластину BCYE агарную пластину — 3 дня.