Выделение и культивирование бактерий, связанных с Caenorhabditis elegans

Начните с многоколодной пластины с стерильными шариками и буфером в каждой колодце.

Добавьте нематоду C. elegans в каждую скважину для выделения бактериального сообщества.

С помощью гомогенизатора механически разрушайте нематоды, чтобы выпустить бактерии в буфер.

Центрифуга, чтобы отделить клеточный мусор и собрать супернатант, содержащий бактерии.

Разбавленный бактериальный раствор нанесите на селективные агарные пластины с разным составом для поддержки роста различных типов бактерий.

Инкубировать пластины, чтобы бактерии могли размножаться и формировать видимые колонии.

Используя стерильную петлю, выберите одну изолированную колонию и нанесите её на свежую пластину того же материала.

Инкубировать пластины, чтобы обеспечить рост чистых бактериальных колоний.

Инокулируйте каждую чистую колонию в соответствующую жидкую среду и инкубируете.

Эти бактерии вырастают в чистые культуры, каждая из которых представляет собой бактериальный вид, естественно связанный с C. elegans.

Для выделения бактерий подготовьте пластину на 96 лунок примерно с тремя стерильными шариками диаметром 1 миллиметр, 20 микролитрами буфера M9 на каждую скважину и пипеткой наместите по одной промытой нематоде в каждую скважину с минимальным количеством жидкости. Раздробите нематоды, как показано, перед использованием гомогенизатора для шариков, затем кратковременное центрифугирование пластины, чтобы жидкость опустилась на дно. После этого соберите подвеску и последовательно разведите её в пропорциях от одного до десяти.

Нанесите до 100 микролитров разбавленной суспензии на 9-сантиметровые агарные пластины. Затем инкубировать пластины при 15–20 градусах Цельсия в течение 24–48 часов. Чтобы получить чистую бактериальную культуру, с помощью стерильной петли или зубочистки выделите одну колонию из инкубированной пластины и нанесите её на новую агарную пластину с той же агарной средой, что и при очистке. Убедитесь, что используете только треть пластины.

Затем простерилизуйте многоразовую петлю или используйте новую стерильную петлю и проведите её через первую полосу, чтобы создать вторую полосу на другой трети пластины. Повторите, протаскивая петлю через вторую полосу и создавая третью, чтобы добиться роста одной колонии.

Инкубировать пластину при тех же условиях роста, что и для изоляции, и при необходимости повторить этап очистки. Выращивайте чистые колонии в жидкой среде при одинаковой температуре и условиях роста.