Обнаружение экспрессии целевых генов в мозге мышей, инфицированного бактериями

Возьмём всю РНК, извлеченную из мозга мыши, заражённого патогенными бактериями. Экстракт содержит транскрипты генов, чувствительных к инфекции.

Добавьте фермент, разрушающий ДНК, и инкубируйте, чтобы разложить остаточную геномную ДНК.

Добавьте мастер-микс, содержащий фермент обратной транскриптазы (RT), нуклеотиды и неспецифические праймеры.

Инкубировать для синтеза комплементарной ДНК (кДНК).

Введите высокую температуру для инактивации фермента RT.

Возьмём мастер-смесь с ДНК-полимеразой, нуклеотидами, двуцепочечной красителем, связывающим ДНК, и праймерами, специфичными для целевого гена.

Добавьте кДНК и нагрейте ДНК для денатурации.

Праймер связывается с целевой кДНК, что позволяет синтезировать новые цепи ДНК.

Цикл повторяется для усиления целевого гена.

Краситель связывается с амплифицированной ДНК и излучает флуоресценцию, которая фиксируется в конце каждого цикла.

Повышение флуоресценции подтверждает экспрессию гена, реагирующего на инфекцию, в мозге инфицированной мыши.

Инфицировать всех мышей с помощью планктонных или биопленочных клеток и провести эвтаназию, как описано в текстовом протоколе. Далее извлеките всю РНК из ткани мозга с помощью набора для экстракции РНК.

Для каждой мыши используйте целую ткань мозга для извлечения РНК. Разделите всю ткань мозга на пять трубок. Возьмите до 100 миллиграммов мозговой ткани и добавьте 1 миллилитр раствора лизиса в каждую трубку, содержащую лизисную матрицу, предоставленную набором.

Извлекать РНК следуя шагам, указанным в текстовом протоколе. Далее провести синтез cDNA, включая ликвидацию геномной ДНК, с помощью термоциклера с набором реагентов обратной транскрипции. Добавьте 1 микрограмм РНК в пробирку, содержащую 2 микролитра 5x буфера для элиминации геномной ДНК и 1 микролитр фермента для элиминации геномной ДНК.

Добавьте воду без РНазы до тех пор, пока объём не достигнет 10 микролитров. Инкубировать 2 минуты при 42 градусах Цельсия. Добавьте 10 микролитров мастер-смеси в реакционный раствор и аккуратно перемешайте.

Немедленно приступите к обратной транскрипции, установив трубку при 37 градусах Цельсия на 15 минут. Затем переведите реакцию на 85 градусов Цельсия на 5 секунд. Проведите количественный анализ ПЦР в реальном времени с помощью аппарата реального времени с кибер-количественным набором для ПЦР в реальном времени. Следуя инструкциям набора, комбинируйте фермент, праймеры, 50x ROX эталонный краситель два и шаблон cDNA. Затем добавляйте воду без РНаз, пока не достигнет общего объёма 20 микролитров.

Запустите каждый образец в трёх экземплярах с использованием тепловых параметров, указанных в текстовом протоколе, и вычислите относительный сдвиг на основе метода КТ с двумя минус дельта-дельта.