Инфекция Drosophila melanogaster патогенными бактериями

Возьмите флакон с крышкой, в которой хранится питательный агар, покрытый фильтровой бумагой.

Нанесите суспензию патогенных бактерий на фильтрующую бумагу.

Введите в флакон голодную муху Drosophila melanogaster , затем закройте крышку. Инкубировать для обеспечения кормления и обеспечения бактериального поедания.

Проглатываемые бактерии попадают в кишечник и проникают через защитную мембрану, выстилающую просвет.

Бактерии прилипают к подлежащему эпителию, выделяют токсины, способствующие повреждению и инвазии эпителия, а также колонизируют внутренние ткани.

Окуните муху в спирт, чтобы удалить бактерии, связанные с поверхностью, затем прополоскайте, чтобы удалить спирт.

Добавьте буфер и гомогенизуйте муху, чтобы освободить внутренние бактериальные содержимости.

Проведите серийное разбавление гомогената в микропластине. Далее разбавляйте разбавления на питательный агар и инкубируете, чтобы обеспечить формирование колонии.

Подсчитайте колонии, чтобы определить количество жизнеспособных бактериальных клеток, возникающих в результате инфекции полости рта у мухи.

За два-четыре часа до орального заражения переместите мух в стандартные агарные флаконы, не содержащие еды. Тем временем для каждой мухи готовьте флакон с инфекцией.

Сначала наполните крышку 7-миллилитровой пробирки 500 микролитрами стандартного сахарного агара и дайте ей затвердеть. Далее вставьте диск фильтрующей бумаги в агар. Затем пипетка 100 микролитров бактериальной культуры непосредственно на фильтрующий диск. Для контроля используйте 5% сахарозной воды.

После периода голодания пересадите одиночных мух в подготовленные трубки. После инкубации мух в течение 18–24 часов проводите поверхностную стерилизацию. Погрузите пациентов в пробирку с 100 микролитрами этанола 70%.

Через 20–30 секунд удалите этанол и замените его на 100 микролитров тройной дистиллированной воды. Через 20–30 секунд удалите воду. Затем добавьте 100 микролитров PBS и угомонизуйте муху.

Перенесите гомогенат в верхний ряд пластины с 96 лунками и добавьте 90 микролитров 1x PBS в каждую скважину ниже. Затем, используя 10 микролитровых аликвот, последовательно разведите этот образец, чтобы выделить диапазон значений КФУ. Далее посерийно разбавляйте на пластину с питательным агаром LB в 5-микролитровых каплях.

Расположите капли так, чтобы они незаметно лежали на пластине. Затем инкубировать тарелку на ночь. На следующий день рассчитайте количество CFU из разбавления, которое образует от 10 до 60 хорошо видимых колоний.