Коинфильтрационный анализ для скрининга эффекторов патогенов, подавляющих заглушание РНК растений

Возьмём смесь, содержащая равные объёмы двух суспензий Agrobacterium tumefaciens , каждая из которых содержит плазмидный кодирующий GFP, а другой — эффекторный белок.

Проколите отверстие и используйте безиглочный шприц, чтобы проникнуть смесь в нижнюю поверхность здоровых, полностью расширенных листьев Nicotiana benthamiana 16c.

Промокните избыточную суспензию мягкими тканями, чтобы предотвратить избыточный рост бактерий.

Отметьте инфильтрированные участки и инкубируйте растения в оптимальных условиях роста.

Agrobacterium переносит плазмидную ДНК в клетки растения, где гены GFP и эффекторов транскрибуются в мРНК и транслируются в белки.

Система защиты станции использует заглушание РНК, при котором дуплексные siRNA загружаются в RISC. Пассажирская нить удаляется, а направляющая направляет комплекс к разложению целевого GFP мРНК.

Однако эффекторные белки связываются с siRNA, препятствуя их ассоциации с RISC и позволяя флуоресценции GFP сохраняться.

Это позволяет выявлять эффекторы патогенов, которые подавляют заглушание РНК растений.

Смешайте равные объемы культуры Agrobacterium , содержащей 35S зелёный флуоресцентный белок, с культурой Agrobacterium , содержащей 35S супрессор вируса мозаики огурца 2b, предполагаемый эффектор или пустой вектор. Используя 1-миллилитровый безиглый шприц, аккуратно и медленно инфильтруйте смешанные суспензии Agrobacterium на абаксиальных сторонах листьев Nicotiana bethamiana 16c.

Удалите оставшиеся бактериальные остатки с листьев мягкими салфетками и обведите края инфильтрированных участков маркерной ручкой.