Оценка бактериального уничтожения в in vitro фагоцитами селезёнки новорождённых мышей

Начните с механической диссоциации селезёнки новорождённых мышей для создания одноклеточной суспензии.

Перенесите подвеску в трубку, установите центрифугу и удалите супернатант.

Суспензировать гранулу в буфере лизис, чтобы устранить эритроциты.

Добавьте буфер, снова центрифугу и удалите супернатант.

Ресуспензировать клетки в буфере и инкубировать с помощью магнитных микробусин, покрытых антителами, направленных на рецептор, экспрессируемый на нейтрофилах и воспалительных моноцитах.

Центрифугуйте и удалите незавязанные шарики. Добавьте буфер, затем пропустите подвеску через ферромагнитную колонку и примените магнитное поле для удержания элементов, связанных с шариками.

Удалить магнитное поле, элюировать клетки буфером и засеять их в многоколодную пластину.

Добавляйте увеличивающиеся концентрации люминесцентных бактерий в выбранные скважины.

Инкубируйте, чтобы нейтрофилы и моноциты могли внутреннее поглощение бактерий через фагоцитоз.

Замените среду на субстрату с антибиотиками, чтобы устранить неинтернализированные бактерии.

Фиксировать люминесценцию с регулярными интервалами для оценки интернализации бактерий и последующего уничтожения, вызванного фагоцитозом.

Для проведения экстракорпорального бактериального анализа поместите неинфицированную селезёнку в 40-микрометровый нейлоновый фильтр в стерильную 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую 5 миллилитров PBS, дополненную 10% сывороткой плода из крупного рогатого скота, и используйте стерильный 3-миллилитровый поршень для шприца для разложения ткани в одну клеточную суспензию. Перенесите клетки в 15-миллилитровую центрифугную трубку и собирайте их центрифугированием. Суспензировать гранулу в 1 миллилитре буфера для лизиса эритроцитов на 3–4 селезёнки.

Через 5 минут при комнатной температуре промыйте селезёнку в PBS и снова суспензуйте гранулу в 250 микролитрах PBS с добавлением бычий сывороточный альбумин и 2 миллимолярной EDTA для подсчёта. Далее изолируйте положительные клетки Ly6 B2 соответствующими иммуномагнитными шариками согласно протоколу производителя и засейте обогащённые клетки Ly6 B2 в размере 1 умножить на 10–5 клеток на 100 микролитров полной плотности на одну скважину в чёрной или белой пластине с 96 лунками. Подготовьте бактериальный инокулюм при желаемой степени заражения в итоговом объёме 100 микролитров на одну скважину и добавьте 100 микролитров бактериального инокуля или среды отдельно в каждую яму, для инкубации в течение 1 часа в инкубаторе клеточной культуры.

В конце инкубации замените среду на 200 микролитров свежей полной среды с добавлением 100 микрограммов на миллилитр гентамицина для удаления оставшихся внеклеточных бактерий и верните клетки в инкубатор для клеточной культуры ещё на 2 часа. В конце инкубации и в каждом последующем экспериментальном моменте используйте считыватель пластин, чтобы измерить люминесценцию в каждой яме крышки культивирующей пластины, прежде чем вернуть пластину в инкубатор клеточной культуры до следующего показания.