Подготовка культуры агробактерий для передачи генов в клетки растений

Начните с культуры Agrobacterium tumefaciens , выращенной в среде, дополненной двумя антибиотиками для предотвращения загрязнения и обеспечения удержания плазмид.

Бактерии содержат экспрессионный вектор растений, несущий интересующий ген и ген устойчивости к антибиотикам.

Они также содержат вспомогательную плазмиду с областью генов вирулентности, необходимой для доставки интересующего гена в клетки растений.

Перенесите часть в пробирку с буферной средой, дополненной ацетосирингоном — молекулой сигнала растения и антибиотиками. Инкубировать с помощью встряхивания.

Ацетосирингон диффундирует в клетку, запускает сигнальный путь и активирует экспрессию генов вирулентности, необходимых для переноса интересующего гена.

Перенесите культуру, центрифугуйте для сбора бактерий и выбросьте супернатант.

Добавьте соляный буфер и многократно промывайте клетки, чтобы удалить добавленные антибиотики.

Суспензировать бактерии в буфере с помощью ацетосирингона и инкубировать без встряхивания для поддержания экспрессии гена вирулентности.

Используйте культуру немедленно для эффективного преобразования.

Используйте кончик, чтобы выделить положительную колонию из пластины LB и инокулировать клетки в стеклянную трубку с 5 миллилитрами LB среды с добавлением 50 микрограмм на миллилитр канамицина и 50 микрограммами на миллилитр рифампицина. Выращивайте клетки при 30 градусах Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин в течение 24–48 часов.

Пересадите 100 микролитров посева в 5 миллилитров LB среды с добавлением тех же антибиотиков: 10 миллимолярных MES при pH 5,6 и 20 микромолярных AS. Выращивайте бактерии при 30 градусах Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин в течение 16–20 часов. Центрифугуйте клетки при 4000 раз на г в течение 10 минут. Сбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу в 2 миллилитрах буфера хлорида магния 10 миллимоляров.

Повторите промывку, чтобы полностью избавиться от антибиотиков. Определите плотность культуры Agrobacterium , измерив оптическую плотность на 600 нанометрах. Скорректируйте культуру клеток с буфером хлорида магния 10 миллимоляров до_{OD 600} от 1,5 до 2,0.

Добавьте 10 миллимолярных MES при pH 5,6 и 150 микромолярных AS к итоговой культуре суспензии и инкубируете клетки при комнатной температуре не менее 3 часов без встряхивания.