Выделение и культивирование бактерий из эмбрионов данио для оценки нагрузки на инфекцию

Возьмём эмбрион данио, инфицированный Mycobacterium abscessus — патогенной бактерией, которая поражает центральную нервную систему и образует абсцессы с бактериями и иммунными клетками хозяина.

Инкубировать эмбрион на льду, чтобы обездвижить его, затем подвергнуть его передозировке анестетика, чтобы остановить сердечную и нервную активность, что приведёт к смерти.

Промыйте эмбрион, чтобы удалить остаточный анестетик.

Добавьте детергентный раствор для нарушения клеточных оболочек и лизирования эмбриона.

Срезать лизат иглой, чтобы гомогенизировать ткань и выпустить бактерии.

Центрифуга, сбросьте супернатант и подвесьте гранулу в растворе поверхностно-активного вещества, чтобы предотвратить скопление бактерий.

Последовательно разбавлять бактериальную суспензию и распределять её на агарные пластины.

Среда дополняется антибиотиками для подавления роста других микробов, в то время как клетки Mycobacterium , созданные для устойчивости к антибиотикам, размножаются.

Инкубировать для стимулирования формирования колоний, позволяя количественно оценивать бактериальную нагрузку эмбриона.

Для перечисления колониообразующих единиц (CFU) в нужное время соберите по пять эмбрионов на каждое инфекционное состояние и перенесите каждый эмбрион в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра. Криоанестезируйте эмбрионы, инкубируя на льду в течение 10 минут. После эвтаназии эмбрионов с 300–500 миллиграммами на литр трикаина используйте стерильную воду для дважды промывания эмбрионов в новой трубке.

Далее, после удаления воды с 2% Triton X-100 в 1 X PBS для каждого эмбриона, и использование иголки 26 калибра для гомогенизации ткани для полного лизиса.

После центрифугирования подвески используйте 1 X PBST для повторного подвески гранулы. Затем последовательное разбавление гомогенатов на Middlebrook 7H10O ADC с добавлением BBL MGIT PANTA.

Инкубировать пластины при 30 градусах Цельсия в течение 4 дней перед подсчетом колоний.