Подготовка фрагментов, органотипической культивирования тканей и люциферазы Запись часы активность генов в супрахиазматическое ядро

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать, как разрезать и препарировать супраматическое ядро у трансгенных мышей и культивировать схематическую ткань для записи экспрессии гена или белка часов в виде люциферазы, индуцированной люминесценцией. Это достигается путем предварительного препарирования мозга трансгенной мыши, которая содержит люциферазный репортер для часового гена или белка, а затем создания среза мозга, содержащего надматическое ядро. Вторым этапом процедуры является выделение небольших двусторонних схематических ядер из среза.

Третьим этапом процедуры является культивирование схематического эксплана ядра на мембране в чашке Петри, содержащей культуру, среду и люцифериан. Заключительным этапом процедуры является регистрация активности люциферазы путем измерения биолюминесценции с помощью фотоумножителей в светоплотной нагреваемой камере. В конечном итоге можно получить результаты, которые выбрали циркадные колебания часового гена или белка.

Меня зовут Сергей IV и я работаю в клубе Gabrielle Re. Меня зовут SoFi Johansson, и я работаю в команде Габриэллы. Меня зовут Габриэль Квист.

Меня зовут Ка Лашон, я аспирант в Шведском медицинском центре неврологии, и я сотрудничаю с Габриэллой. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как вестерн-блоттинг R-T-P-C-R, и при двух гибридизациях заключается в том, что экспрессию часового гена или белка можно отслеживать непрерывно в течение многих дней в одной и той же ткани с очень высоким разрешением около одной минуты, что позволяет детально анализировать амплитуду периода и лицо циркадного ритма. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы среза и препарирования SEN сложны для изучения.

SEN очень мал, и его может быть трудно идентифицировать. Демонстрировать процедуру будет доктор Сге Велиа, постдокторант в моей исследовательской группе. После приготовления необходимых растворов приготовьте чашки Петри, которые будут использоваться в эксперименте, с помощью пятимиллилитрового шприца, предварительно заполненного автоклавной вакуумной смазкой.

Нанесите смазку на поверхность верхнего кольца 35-миллиметровой чашки Петри. Приготовьте отдельную чашку Петри для каждого ломтика. Культура. Заполните пробирку Falcon 10 миллилитрами воздуха, буферизуя питательную среду.

Этого будет достаточно для восьми культур. Добавьте 10 микролитров только что размороженного люцифериана. Люцифериан чувствителен к свету, поэтому защитите люцифериеву среду от света, храня трубку Falcon в темной нагревательной камере с температурой 37 градусов Цельсия.

Далее простерилизуйте все инструменты, накройте стекла и другие материалы, которые будут использоваться в процедуре. Распылите на все нестерильное оборудование 70% этанола. Подвергайте инструменты и смазанные маслом чашки Петри воздействию ультрафиолета в стерильном колпаке не менее 30 минут.

Еще одним подготовительным этапом является настройка вибрато и прикрепление стерильного лезвия бритвы. В настоящее время оборудование настроено для проведения хирургической процедуры. После обезболивания и обезглавливания мыши удалите глаза с головы ножницами.

Это препятствует тренировке или возбуждению зрительных нервов, что помогает избежать повреждения схематического ядра или СХЯ. С помощью тонких ножниц удалите последний шейный позвонок и снимите кожу. Сделайте два надреза в кости черепа по обеим сторонам черепа, сделав таким образом съемную крышку.

Вскройте череп с помощью микроинструмента Ron Jre. Используйте RJ восходящим движением, никогда не надавливая инструментом на мозг. Чтобы предотвратить повреждение початка SCN, удалите всю кость до тех пор, пока не будут видны обонятельные луковицы.

С помощью тонких пружинных ножниц для микрорассечения аккуратно разрежьте зрительный нерв между полушариями и обонятельными луковицами. Пожалуйста. Чашка Петри, наполненная от 50 до 100 миллилитров холодного HBSS под головой мыши. Переверните голову вверх ногами и дайте неповрежденному мозгу начать выпадать.

При необходимости перережьте другие черепно-мозговые нервы на противоположной от зрительного нерва стороне. При отрыве мозг попадает в чашку Петри, которая быстро охлаждает мозг. С помощью ложки перенесите ледяной мозг на стерильную режущую поверхность, например, на стеклянную крышку чашки Петри, перевернутую вверх дном.

Удалите мозжечок, сделав перпендикулярный надрез стерильными бритвенными лезвиями между полусферами и мозжечком. Нанесите суперклей на сухую поверхность виома. Введите остро изогнутые щипцы в ростральную часть мозга и подхватите мозг, удерживающий мозг с помощью щипцов.

Тщательно высушите HBSS на стерильной фильтровальной бумаге. Закрепите полусферы на клее на платформе ростральным кончиком вверх и ближайшей к режущему лезвию брюшной поверхностью. Прикрепите платформу в держатель вибрато и сразу же заполните ее холодным HBSS.

Если перпендикулярный срез выполнен правильно, полусферы должны стоять прямо вверх. Цель состоит в том, чтобы разрезать корональные срезы, содержащие среднюю область двустороннего SCN, используя максимальную скорость вибрато. Начинайте отрезать участки полусфер толщиной от 500 до 800 микрометров, пока не дойдете до спайки. Часы.

По мере расширения оптического хиазма, сопровождающегося уменьшением секций до толщины 100 микрометров, продолжайте нарезку вниз в направлении початка, замедляя горизонтальное ручное движение лезвия до тех пор, пока не начнут появляться два ядра SCN. При необходимости используйте лупу для визуализации ядер при достижении уровня SCN. Вырежьте секцию SCN 250 микрометров.

Наполните крышку от чашки Петри среднего размера холодным HBSS с помощью мягкой щетки. Поднимите и перенесите участок мозга SCN в чашку Петри. Поместите чашку Петри под препарирующий микроскоп.

Следующим шагом будет выделение SCN из среза. С помощью микроскопа убедитесь, что двусторонняя СХЯ хорошо видна по крайней мере с одной стороны среза. С помощью пары стерильных скальпелей рассеките квадрат ткани, примерно по 1,5 миллиметра с каждой стороны, содержащий оба SCN.

Режьте как можно ближе к SCN. Без удаления ткани СХЯ к пояснице необходимо прикрепить небольшой кусочек зрительного нерва, но не включить другие ядра. Разрежьте ткань, содержащую двустороннюю СХЯ, пополам для получения двух односторонних СХЯ.

Один односторонний СХН может быть использован в качестве контроля в стерильном капюшоне. При выключенном свете добавьте 1200 микролитров среды «Люцифер» в чашку Петри диаметром 35 мм, а затем поместите культуральную мембрану поверх поверхности жидкости. Убедитесь, что под мембраной нет пузырьков воздуха.

Имплантаты крошечные, и их трудно прихватить. Поэтому используйте пипетку объемом 1000 микролитров с наконечником, чтобы всасать эксплан SEN в наконечник и прижать его к культуральной мембране. Отбросьте избыток HBSS для записи люциферазы, поместите только один SEN на чашку Петри.

Запечатайте чашку Петри смазкой с покровным стеклом диаметром 40 миллиметров. Добавьте больше смазки, если уплотнение не затянуто. Переложите чашки Петри в аппарат цикла алюма, помещенный в светогерметичную камеру нагрева при температуре от 36 до 37 градусов Цельсия.

Чтобы начать культивирование, обратите внимание на чашки для культивирования и детекторы с фотоумножителем, установленные внутри камеры люмового цикла. Расположите тарелки для культуры ниже фотоумножителей примерно на один-два сантиметра. Фотоумножители обнаруживают и усиливают люциферазу, индуцированную люминесценцией.

Для сбора данных используется программный инструмент Luma Cycle. Подсчет фотонов интегрируется с интервалом от одной до 10 минут для получения высокого разрешения экспрессии белка гена. Циркадная экспрессия белка гена анализируется для определения фазового периода и амплитуды ритма.

На этом рисунке показаны записи биолюминесценции из здоровых и нездоровых культур тканей SCN. Эти мыши содержались в течение 12 часов света и 12 часов в темноте перед удалением ткани SCN. Черная линия показывает циркадный ритм биолюминесцентных записей экспрессии люциферазы второго периода.

В здоровом срезе SEN белок колеблется с циркадными вариациями, при которых максимальная экспрессия белка происходит в определенное время, от 12 до 13 лет или с наступлением темноты. Таким образом, фаза генного ритма зависит от светлого темного графика, в котором животное содержалось до жертвоприношения. Синей линией показаны записи биолюминесценции с СЭ и культуры, которые высохли после того, как чашка для культуры была открыта на четвертый день, указанный стрелкой, и не запечатаны должным образом.

Красной линией показаны записи биолюминесценции из нездоровой культуры SCN. На этом рисунке используется культура SCN в фармакологическом эксперименте. На рисунке показан след от культуры, которая была обработана блокатором ионных каналов HCN в момент, указанный первой стрелкой.

В течение двух-трех дней блокатор ионных каналов уменьшал, а затем останавливал циркадные колебания на второй стрелке. Во время этой процедуры препарат вымывали и заменяли кондиционированной контрольной средой. Важно помнить, что нужно работать быстро, но осторожно, чтобы сохранить жизнеспособность ткани SEN.

Также важно стандартизировать секцию вибрама, чтобы каждый раз был получен один и тот же уровень SEN. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как срезать и препарировать культуру SEN, орган SCN, как правило, на мембране, и отслеживать экспрессию гена часов или белка в виде люциферазы, индуцированной люминесценцией в культурах.