JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 2:46 мин • February 26th, 2026
Начните с супернатанта, вырабатываемого микробиотой кишечника человека во время экстракорпоральной ферментации экзополисахаридов. Супернатант содержит депротонированные короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA) и другие метаболиты.
Добавьте метафосфорную кислоту, чтобы снизить pH супернатанта, и вихрь для тщательного смешивания. Это преобразует SCFA в их протонированные формы, подходящие для анализа с помощью газовой хроматографии.
Центрифуга для разделения мусора и сбора супернатаната, содержащего SCFA и другие метаболиты.
Фильтруйте супернатант, чтобы устранить остаточный мусор и избежать помех с хроматографией.
В системе высокопроизводительной газовой хроматографии вводят супернатант в нагретый вход для испарения. Затем смешайте пар с инертным газом и пропустите его через полярную колонку стационарной фазы для разделения.
SCFAs взаимодействуют с неподвижной фазой колонки и разделяются в зависимости от летучей способности, при этом короткоцепочечные кислоты выделяются раньше, чем более длинные.
Определите концентрации различных SCFA, сравнивая результаты с внутренними стандартами. Это отражает микробное разложение экзополисахаридов при условиях, подобных кишечнику
Для изучения влияния EPS на производство SCFA добавьте 1 миллилитр ферментированных супернатантов в 2-миллилитровые центрифугные пробирки и добавьте 0,2 миллилитра 25% метафосфорной кислоты в каждый образец. Вихрь для тщательного смешивания растворов. Центрифугуйте смеси по 13 000 г в течение 20 минут.
Тем временем приготовьте растворы 120-миллимолярной уксусной, пропионовой, бутировой, изобутировой, валериновой и изовалереновой кислот в пробирках. Затем добавьте 1 миллилитр каждой подготовленной кислоты в пробирку с 1,2 миллилитра метафосфорной кислоты 25% веса/объём и загрузите их в пробную бутылку газово-хроматографического прибора как стандартные коктейли.
Вынимите трубки из центрифуги и перенесите супернатанты в свежие. Используйте шприц с фильтром 0,22 микрона, чтобы фильтровать супернатанты в новые трубки для газохроматографического анализа.