Таймлапс-визуализация сегрегации хромосом у флуоресцентно маркированных бактерий

Начните с богатой питательными веществами агарозной подушки на металлическом каркасе, содержащей бактерии, экспрессирующие флуоресцентно маркированные хромосомы и флуоресцентные микросферы.

Агарозная подушка поддерживает прикрепление и подвижность бактерий, а флуоресцентные микросферы служат ориентиром для отслеживания сегрегации хромосом.

Добавьте иммерсионное масло в объективную линзу в предварительно нагретой инкубационной камере инвертированного широкопольного микроскопа.

Разместите образец над линзой, затем сфокусируйтесь на области, содержащей несколько бактерий и как минимум одну флуоресцентную микросферу.

Инициировать таймлапс-съёмку и зафиксировать как фазово-контрастные, так и флуоресцентные изображения.

Флуоресцентно помеченное происхождение репликации появляется в виде яркого скопления возле одного конца клетки.

Во время деления происхождение дублируется; один кластер остаётся на исходном конце, а другой мигрирует к новообразованному концу клетки.

Такая система позволяет отслеживать сегрегацию хромосом в нескольких делениях и может быть адаптирована для визуализации аналогичных динамических процессов у других бактерий, включая патогенные виды во время взаимодействия с хозяином.

Для проведения таймлапс-микроскопии включите микроскоп и запустите программное обеспечение управления микроскопом. Выберите правильный объектив, а также нужные зеркала и фильтр, чтобы получить изображения фазового контраста, а также изображения белоков с зелёным флуоресцентным, красным флуоресцентным или жёлтым флуоресцентным изображением. Добавьте каплю высококачественного погружного масла на линзу объектива и на дно образца, предварительно инкубированного при 32 градусах Цельсия.

С отверстием к объективу поместите металлическую раму с образцом на ступень микроскопа, затем надёжно закрепите образец в держателе сцены. Сосредоточьтесь на ячейках, приблизив ступень в направлении Z к цели. Когда масло на объективе и образце соприкасаются, перемещайте ступень в направлении X/Y.

Переключитесь на программное обеспечение Metamorph и откройте инструмент «Приобрети». Выберите «Фазовый контраст» в выпадающем списке «Настройки» и установите время экспозиции на 100 миллисекунд. Нажмите «Показать прямой эфир», «Перевести ячейку в фокальную плоскость» и переместить сцену в направлении X/Y, пока в поле зрения не появятся несколько отдельных ячеек.

Убедитесь, что в области обзора находится хотя бы одна флуоресцентная микросфера для дальнейшего выравнивания полученных изображений. Далее откройте мастер многомерного приобретения в программном обеспечении управления микроскопом, чтобы настроить эксперимент с таймлапсом, который позволяет микроскопу получать изображения с разными длинами волн и позициями ступеней при необходимости.

Во вкладке «Главная» активируйте таймлапс и «Несколько длин волн». Дополнительные вкладки появятся слева в окне. Нажмите на вкладку «Сохранение» и выберите «Каталог», чтобы выбрать пустую папку на жёстком диске компьютера для сохранения приобретённых изображений, затем активируйте Increment Base Name If File Exists, чтобы убедиться, что последовательные наборы данных не перезаписывают предыдущие. Дайте эксперименту название с датой и названием сорта или названием эксперимента.

Нажмите на вкладку таймлапса, чтобы настроить параметры таймлапса, затем установите интервал времени на 20 минут и на длительность на 24 часа. Количество очков времени меняется автоматически. Теперь нажмите на вкладку Wavelengths.

Выберите количество длин волн для каждого изображения в каждую точку времени, изменив число. Выберите разрешить отдельную аппаратную запоминающуюся позицию автофокуса для каждой длины волны. Нажмите на вкладку First Wavelength сверху.

В выпадающем списке «Освещение» выберите «Фазовый контраст». Выберите 100 миллисекунд для экспозиции, а в выпадающем списке «Получить» выберите «Каждая точка времени». Отключите Auto Expopose в выпадающем списке, выбрав Never, и выберите Every Acquisition в выпадающем списке для Auto Focus.

Установите экспозицию для каждой длины волны, как только что показано, используя следующие параметры. Затем, чтобы получить изображения с нескольких позиций этапа, во вкладке Main активируйте Multiple Stage Positions. Нажмите на вкладку «Сцена» и нажмите кнопку «Живой эфир», чтобы посмотреть поле зрения.

Двигайте уровень в направлении X/Y, пока в поле зрения не появится ROI. Сохраните координаты X и Y во вкладке «Этап», нажав на плюс. Переместите уровень в направлении X/Y, пока не найдёте новый ROI, и снова сохраните координаты, нажав на плюс.

Продолжайте, пока не сохраните нужное количество регионов. Ещё раз проверьте, что клетки в фокусе, кликнув на разные сохранённые положения X и Y, и запустите аппаратный автофокус, нажав AFC hold, чтобы сохранить сохраненную Z-позицию постоянной в течение эксперимента. Запустите таймлапс-запись в мастере многомерного приобретения микроскопа, нажав Acquire.

Проверьте, остаются ли ячейки в фокусе после первых нескольких точек таймлапс-записи, чтобы максимизировать качество изображений и при необходимости перефокусироваться.