Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 3:48 мин. • February 26th, 2026
Начните с взрослой данио-рерио, инфицированной антибиотикоустойчивым штаммом Vibrio cholerae. Эта патогенная бактерия экспрессирует фермент β-галактозидазы и колонизирует кишечник.
Соберите рыбу и переложите её в раствор с передозировкой анестетика для эвтаназии.
Положите рыбу вентральной стороной вверх и закрепите её булавками.
Продезинфицируйте брюшную полость, сделайте продольный разрез кожи и два боковых разреза в сторону головы, затем закрепите кожу, чтобы открыть кишечник.
Переместите тракт в трубку для гомогенизации с холодным буфером и стеклянными бусинами.
Инкубировать с помощью перемешивания, позволяя стеклянным бусинкам разрушать ткани и выпускать бактерии.
Последовательно разбавляйте гомогенат, накладываете его на среду и инкубируете. Среда содержит хромогенный субстрат β-галактозидазы и антибиотик для устранения загрязнителей.
Бактерии экспрессируют фермент β-галактозидазы, который гидролизирует хромогенный субстрат, способствуя образованию синих пигментных колоний.
Посчитайте колонии, чтобы оценить бактериальную нагрузку кишечника.
Когда эксперимент достигнет желаемой цели, возьмите 15-миллилитровую пробу воды для диагностики. Затем соберите рыбу и правильно утилизируйте заражённую воду. Ориентируйте вентральную сторону вверх и закрепите тело булавкой через нижнюю челюсть и ещё одной булавкой чуть позади ануса.
Наклоните оба штифта в сторону от корпуса. Затем протрите вентральную поверхность рыбы 70% этанола. Затем стерилизуйте скальпель и ножницы Ванна, используя 70% этанола и пламя.
Теперь, используя скальпель, сделайте небольшой продольный разрез на животе, который проникает в чешую, но режет только до глубины кожи. Затем ножницами аккуратно протяните разрез вдоль длины тела, не разрезая глубже уровня кожи. Избегайте резать анус.
Затем сделайте два боковых разреза к головке, чтобы расширить отверстие. Затем прикрепите кожу с обеих сторон боковых разрезов к поверхности рассечения, наклоняя штифты наружу, в сторону от тела. Кишечник теперь должен быть виден в виде очень тонкой, бледной трубки.
Теперь используйте две пары огненно стерилизованных щипцов, чтобы аккуратно удалить весь кишечник, который может быть довольно хрупким. Переместите ткань в гомогенизационную трубку с стеклянными шариками и одним миллилитром холодного буфера. Далее унифицировать ткани, как описано в текстовом протоколе, и количественно оценить уровень колонизации кишечника.
Далее проводите серийное разбавление гомогената и буфера кишечника. Для каждой рыбы приготовьте пять или шесть десятикратных разбавлений в одном миллилитровом объёме. Вихрь трубок для смешивания.
Затем нанесите от 100 до 200 микролитров каждого разбавления на агарные пластины LB, содержащие стрептомицин и X-гал. Инкубировать пластины при 30 градусах Цельсия в течение 16–18 часов. После ночной инкубации посчитайте колонии V. cholerae на пластинах.
Эти бактерии обычно образуют бледно-голубые колонии на LB-среде с X-галом.