Обработка инфицированных тканей для бактериального перечисления в модели коинфекции у мышей

Начните с мыши, соинфицированной патогенной бактерией и вирусом.

Вирус повреждает эпителиальную оболочку верхних дыхательных путей мыши, способствуя распространению бактерий из носоглотки в лёгкие.

Поместите собранные лёгкие мыши в чашу с сосемлявым раствором, содержащим фосфат-буферный раствор, или PBS.

Нарежьте лёгкие на мелкие кусочки и аккуратно перемешайте.

Перенесите половину легкой ткани в трубку с PBS.

Вставьте стерилизованный гомогенизатор тканей внутри трубки, содержащей ткань лёгких.

Гомогенизуйте ткань, чтобы выпустить бактерии в PBS.

Разведите гомогенат и разведите его на богатую питательными веществами агаровую пластину.

Инкубировать пластину для формирования бактериальных колоний.

Подсчитайте эти колонии, чтобы количественно оценить бактериальную нагрузку на лёгкие, которая отражает нагрузку бактерий в лёгких.

Для сбора лёгких с помощью ножниц для вскрытия срезать бока обнажённой грудной клетки и аккуратно подтянуть рёбра к голове мыши, чтобы обнажить сердце. Введите иглу 25-го калибра, прикреплённую к 10-миллилитровому шприцу, предварительно наполненному PBS, в правый желудочек и начинайте медленно перфузировать. Обратите внимание на обесцвечивание лёгких как на показатель успешной перфузии.

Промывайте медленно, чтобы не повредить лёгочную ткань. Поднимите сердце щипцами и сделайте разрез, чтобы разделить лёгкие и сердце. После разделения соберите все доли лёгких щипцем и прополосните в чашке стерильным PBS, чтобы удалить остатки крови.

В чашке Петри измельчите лёгкое на мелкие кусочки и хорошо перемешайте. Удалите половину смеси лёгких, чтобы определить бактериальный CFU или вирусный PFU, и поместите её в круглодонную трубку объёмом 15 миллилитров, предварительно заполненную 0,5 миллилитрами PBS для гомогенизации.

Чтобы гомогенизировать собранную ткань, очистите зонд гомогенизатора, добавив 70% этанола и включив гомогенизатор на мощности 60% на 30 секунд. Повторите этот шаг в стерильной воде в течение 10 секунд.

Гомогенизуйте каждую ткань на 1 минуту. Для перечисления бактериальных номеров — последовательные разбавления пластин на пластинах кровяных агаров. Для расчёта общего количества CFU используйте 10 микролитров для пластины и фиксируйте итоговый объём в миллилитрах для каждого образца. Инкубировать за ночь при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.