Постсинаптических Записи в Афферентные Дендриты Обращение Кохлеарные внутренние волосковые клетки: Мониторинг мультивезикулярные релиз на ленте Synapse

Общая цель этой процедуры заключается в регистрации постсинаптической активности во внутренних афферентных синапсах волосковых клеток. Это достигается путем обнажения сенсорного эпителия улитки, недавно удаленной у обезглавленной крысы. Второй шаг процедуры заключается в позиционировании вырезанной апикальной формы, надевании модифицированной крышки и переносе ее в записывающую камеру.

Третьим этапом процедуры является обнаружение и получение доступа к афферентной дубинке с записывающим электродом. Заключительным этапом процедуры является формирование плотного уплотнения на афферентной волокнистой мембране, а затем разрыв афферентной волоконной мембраны, устанавливая конфигурацию всей клетки с помощью техники патч-зажима. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают постсинаптическое возникновение или потенциалы от одного ленточного синапса через электрофизиологию зажима клеточного участка.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку диссекция и подготовка ткани улитки сложны для изучения, а мелкие афферентные волокна трудно распознать и получить к ним доступ. Перед началом вскрытия подготовьте модифицированную обложку, которая будет удерживать препарат на месте во время записи. С помощью круглого защитного накладки от восьми до 12 мм нанесите каплю наполовину отвержденного защитного кожуха по направлению к краю защитного накладки.

Поместите толстый конец тонкой булавки от насекомых на защитный лист. Крепко прижмите булавку от насекомых к стеклу. С помощью щипцов нагрейте защитный кожух порога о нагретый спираль, чтобы он схватился.

Подготовьте от 10 до 20 микроэлектродов, как описано в сопроводительном тексте. После огневой полировки микроковкой микроэлектрод должен иметь внешний диаметр наконечника примерно в один микрон. Конечная толщина стенки пипетки составляет около одной трети микрометра после обезболивания и обезглавливания трехнедельной крысы.

Начните вскрытие с удаления кожи, рассечения головы и удаления мозга Чтобы обнажить височную кость, удалите обе височные кости. Поместите каждую височную кость в чистую чашку для препарирования, содержащую стандартный внеклеточный раствор. Следующим шагом является удаление кости, инкапсуляция височной кости, чтобы обнажить улитку.

Надежно удерживайте височную кость у основания с помощью щипцов. Определите круглое и овальное окно и улитку. Ориентируйте улитку так, чтобы овальное окно и спиралевидная сторона улитки были обращены вверх.

Удалите лишнюю кость вокруг улитки. Используйте вторую пару тонких щипцов, чтобы отколоть кость непосредственно от улитки, начиная с области, которая более прозрачна, чем остальная часть кости. Здесь кость тоньше и ее легче удалить.

Продолжайте удалять кость вокруг апикальной катушки. Используйте микроножницы для препарирования, чтобы разрезать моди ниже апикального поворота. Затем отсоедините апикальный виток от нижних витков улитки.

Позаботьтесь о защите апикальной катушки. Его нельзя натягивать или растягивать. Наконец, удалите верхушечный виток улитки, не разрывая ткань слишком сильно.

С помощью тонких щипцов удалите оставшуюся часть кости. Следующим этапом является удаление STR окулиса и большеберцовой оболочки. Осторожно удалите STR окулиса, блестящую полоску ткани, расположенную за пределами области волосковых клеток.

Избегайте удаления сенсорных волосковых клеток, которые могут легко отделяться вместе с STR глаза. Затем с помощью тонких щипцов отсоедините тиальную мембрану. Блестящая полупрозрачная мембрана, которая находится над сенсорными волосковыми клетками, теперь обрезает лишнюю ткань и кость и сплющивает препарат с помощью щипцов.

Это необходимо для того, чтобы ткань можно было равномерно разместить под булавкой. Вскрытие завершено. Поместите препарат под булавку на подготовленный защитный листок, стараясь расположить булавку подальше от волосковых клеток после завершения вскрытия.

С помощью щипцов перенесите препарат в записывающую камеру, при этом удерживая каплю внеклеточной жидкости на покровном стекле, который удерживает ткань улитки, немедленно начните обильное нанесение внеклеточного раствора. Чтобы обеспечить лучшую приживаемость препарата, используйте объектив микроскопа с 10-кратным увеличением или 40-кратный объектив для погружения в воду. Чтобы найти препарат, расположите препарат таким образом, чтобы записывающие электроды могли приближаться к внутренним волосковым клеткам под прямым углом к их боковым стенкам.

Если видимость базальной области внутренних волосковых клеток ограничена из-за того, что препарат скручен, используйте записывающий электрод, чтобы прижать внешний край препарата к стеклопакету. Следите за тем, чтобы не сдавливать сами внутренние волосковые клетки. В этом препарате верхний электрод удерживает внешний край препарата вниз по нижним электродным отметкам, где расположены афферентные палочки.

Для справки, камера NC 70 Nuv Con отображает увеличенное изображение Forex на мониторе, чтобы оценить, здорова ли ткань во внутренней области волосковых клеток. Найдите пучки волос в качестве точки отсчета и сосредоточьтесь вниз, чтобы найти ядра. Сосредоточьтесь дальше вниз к основанию внутренних волосковых клеток с их афферентными окончаниями и обратно вверх, пока не достигнете уровня ядер на мониторе.

Теперь расположите афферентные палочки вокруг основания внутренних волосковых клеток. Дубинки имеют сферическую или эллипсоидальную форму, примерно один микрон в диаметре и имеют светлый цвет с блестящим внешним видом. Вы найдете их, сосредоточившись вверх и вниз.

Следующим этапом является расчистка пути к афферентным волокнам с помощью записывающего электрода с наконечником в один микрон, заполненным внутриклеточным раствором. Приложите положительное давление и с помощью микроманипулятора проведите электрод к препарату. С помощью этого электрода сделайте разрез в препарате на уровне внутреннего основания волосковых клеток.

Протолкните электрод между тонким слоем поддерживающих клеток и внутренними волосковыми клетками, используя положительное давление, чтобы проложить путь доступа к области у основания внутренних волосковых клеток. Осторожно снимите электрод и замените его свежим электродом с наконечником диаметром в один микрон, заполненным внутриклеточным раствором. Используя положительное давление для поддержания чистоты кончика электрода, переместите записывающий электрод через отверстие для доступа вокруг соседних поддерживающих элементов в направлении афферентной дубинки.

Убедитесь, что наконечник электрода находится непосредственно перед афферентными дубинками, которые оказывают большее сопротивление движению пипетки, чем поддерживающие клетки и внутренняя мембрана волосковых клеток. Эту разницу можно почувствовать, когда пипетка перемещается, перемещайте пипетку вверх и вниз и нажимайте, чтобы убедиться, что бутон движется. Это указывает на то, что наконечник пипетки и бутон находятся в одной плоскости фокусировки с электродом, прижатым к афферентному бхутону

Применяйте легкие импульсы всасывания, чтобы разорвать мембрану внутри электрода, чтобы получить запись всей клетки. Если заплатенная ячейка представляет собой афферентную дубинку, то в режиме записи всей ячейки наблюдаются небольшие емкостные переходные процессы. На этом рисунке показан типичный переходный процесс, регистрируемый из афферентного волокна.

Начните записывать синаптическую активность. Если афферентное волокно не проявляет спонтанной активности, деполяризуйте волосковую клетку, применив внеклеточный раствор с более высокой концентрацией калия. На этом рисунке показаны типичные соотношения токового напряжения для волокон AFF слева и внутренних волосковых клеток справа.

Были зарегистрированы соотношения напряжения тока в пределах минус 84 милливольт с шагом напряжения от минус 124 милливольт до положительных 36 милливольт с шагом 10 милливольт. Напряжения показаны справа от некоторых дорожек, фокусирующихся на соотношении напряжения тока от афферентного волокна. Обратите внимание, что возбуждающие постсинаптические явления или ЭПК присутствуют на большинстве ступеней напряжения.

EPC обратили положительное значение примерно на положительные шесть милливольт. Эта запись проводилась в присутствии тетратоксина для блокировки потенциал-зависимых натриевых токов без блокиратора Быстрая активация натриевых внутренних токов дополнительно появилась бы в записи и идентифицировала запись как афферентную запись волокна. Обратите внимание, что медленно активирующийся внутренний ток при гиперполяризующих напряжениях.

Этот ток отсутствует во внутренних волосковых клетках или поддерживающих клетках и является хорошим признаком того, что запись происходит от афферентного волокна. Эти записи показывают отношение напряжения тока для внутренней волосковой ячейки. Стрелка указывает на быстро активирующиеся наружу калийные токи с положительными потенциалами.

За ними следуют отсроченные токи калия выпрямителя благодаря узкому диаметру пипетки и высокому сопротивлению доступа. Показанные здесь внутренние токи волосковых клеток меньше, чем ожидалось для получения точных записей внутренних токов волосковых клеток. Следует использовать пипетки с меньшим сопротивлением доступа.

Тем не менее, представленные здесь записи демонстрируют, что соотношения напряжения по току внутренних волосковых клеток и афферентных волокон могут быть четко различимы. На этом рисунке показаны синаптические токи, записанные из афферентного волокна. Обратите внимание на переменный размер и форму EPC.

Записи проводились при комнатной температуре с применением тетратоина для блокировки напряжения стробированных токов натрия. На этом рисунке показаны одновременные записи с внутренней волосковой клетки и контактирующей афферентной дубинки. Ступень напряжения использовалась для деполяризации внутренней волосковой клетки, и в ответ на это были зарегистрированы входящие токи кальция от внутренней волосковой клетки, приток кальция приводит к высвобождению нейротрансмиттеров и активации EPC в афферентной дубинке.

Обратите внимание, что синаптическое углубление появляется во время 50-миллисекундной деполяризации внутренних волосковых клеток во время попытки этой процедуры. Важно помнить о необходимости проявлять осторожность при рассечении и подготовке ткани улитки, а также сохранять терпение и оптимизм при попытке записи с афферентных окончаний.