Образование сферопластов из грамотрицательных бактерий

Возьмите среду с антибиотиком, блокирующим деление клеток.

Инокулируйте его палочкообразными, грамотрицательными бактериями.

Инкубировать с помощью встряхивания.

В присутствии антибиотика бактерии продолжают расти, не делясь, и образуют длинные нити.

Соберите культуру и центрифугуйте при низкой температуре. Сбросьте супернатант и промывайте филаменты раствором сахарозы, чтобы предотвратить лиз.

Отбросьте раствор сахарозы.

Добавьте буфер, затем ферменты и ЭДТА. ЭДТА ослабляет внешнюю мембрану, позволяя лизоциму проникнуть и разрушать слой пептидогликана.

Это удаляет клеточную стенку, позволяя бактериальной клетке уменьшиться. ДНКаза I разрушает высвобождённую хромосомную ДНК из клеток и предотвращает слипание клеток.

Добавьте гипотонический раствор с лёгким завитком, позволяя клетке втягивать воду.

Гибкие мембраны позволяют клетке принимать сферическую форму, называемую сферопластом.

Переместите аликвот со сферопластами в две трубки с охлаждённым изотоничным раствором для стабилизации сферопластов.

Для приготовления грамотрицательных E.coli сферопластов разведите ночную культуру в соотношении 1 к 100 в 25 миллилитрах TSB в колбасе объемом 250 миллилитров и вернуте бактерии в трясущий инкубатор ещё на 2,5 часа. Когда раствор достигнет оптической плотности от 0,5 до 0,8 при 600 нанометрах, разведите культуру в соотношении один к десяти в свежем TSB в новой колбе объемом 250 миллилитров для второй инкубации продолжительностью 2,5 часа с конечной эффективной концентрацией 60 микрограмм на миллилитр цефалексина.

Создавать одноклеточные филаменты длиной примерно от 50 до 150 микрометров, визуализируемые под световым микроскопом при увеличении в 1000 раз. Центрифугуйте бактериальный раствор для извлечения нитей и декантуйте супернатант. Промыйте филаменты аккуратно добавлением одного миллилитра сахарозы 0,8 моляра, стараясь не потревожить гранулу.

Через минуту сбросьте супернатант, не трогая гранулу, и добавляйте указанные реагенты в соответствующем порядке к филаментам. Через десять минут при комнатной температуре постепенно добавляйте один миллилитр раствора A в течение одной минуты, аккуратно перемешивая его вручную. Инкубировать раствор в течение четырёх минут при комнатной температуре, затем разделить суспензию филамента на две равные аликвоты между двумя коническими трубками по 15 миллилитров, содержащими семь миллилитров раствора B по четырёх градусам Цельсия. Далее гранулируйте филаменты центрифугой и аккуратно удаляйте серологическую пипетку, кроме одного-двух миллилитров супернатанта, не нарушая гранулы.

Используйте микропипетку p1000, чтобы аккуратно подвесить гранулы. Проверьте небольшой аликвот образца на наличие сферопласта с помощью световой микроскопии. Затем сферопласт можно хранить при минус 20 градусах Цельсия до недели или до тех пор, пока он не пройдёт три цикла заморозки и оттаивания.