Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 3:47 мин. • February 26th, 2026
Начните с двух микротарелок с стеклянным дном, содержащих суспензии бактерии, образующей биопленку.
В лечебной антенне используется активный фермент, нарушающий сигнализацию, а в контроле — инактивированный фермент.
Накройте чашки и инкубируете, чтобы бактериальные прилипали к поверхности микротарелки.
Промыть, чтобы удалить не прилипающие клетки, затем ввести свежую среду с ферментами и инкубировать.
В контрольной антенне бактерии общаются через сигнальные молекулы и производят внеклеточные полимерные вещества (EPS), образуя биопленку.
Активный фермент разрушает сигнальные молекулы, нарушая их функцию и снижая образование биопленки.
Пополните его свежим средством и дополнительно инкубируете, чтобы усилить эффект фермента, разрушающий биопленку.
Удалите среду, добавьте флуоресцентно маркированные лектины и инкубируете, чтобы обеспечить связывание лектина с EPS.
Промыть, чтобы удалить незавязанный лектин.
Инкубировать с фиксативом для сохранения биопленочной архитектуры, затем промыть чашу.
Получить изображения конфокальной микроскопии для оценки подавления образования биопленки, опосредованного ферментами.
Для проведения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) биопленок A. baumannii S1 выращивайте культуру A . baumannii S1 объемом 5 миллилитров в LB при 30 градусах Цельсия в трясущемся инкубаторе в течение 16 часов. Скорректируйте культуру A. baumannii S1 доOD 600 равного 0,8.
Затем используйте свежий LB с 1,2 миллиграмма на миллилитр очищенного фермента GKL, чтобы разбавить культуру от 1 до 100, и добавьте 1 миллилитр в микрочашку с стеклянным дном объемом 35 миллилитров. Накройте микротарелку крышкой, поставьте её в пластиковый контейнер на 10 литров и запечатайте перед тем, как инкубировать при 30 градусах Цельсия в течение трёх часов. После аккуратного удаления среды добавьте 1 миллилитр свежей среды с 30 микролитрами очищенного фермента GKL, затем инкубируете при 30 градусах Цельсия ещё 21 час.
Аккуратно снимите среду во второй раз и замените его ещё 1 миллилитром фермента GKL в свежем виде. Инкубировать при 30 градусах Цельсия в течение 24 часов. После инкубации аккуратно удалите среду и добавьте 500 микролитров 5 микрограмм на миллилитр конъюгированного агглютинина зародыша пшеницы Alexa Fluor 488, растворённого в HBSS.
Инкубировать микротарелку при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы окрасить биопленки. Для фиксации биопленок добавьте 500 микролитров 3,7% формальдегида, растворённого в HBSS, и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Используйте 2 миллилитра HBSS, чтобы один раз помыть микропосуду, затем полностью удалите раствор.
Храните блюдо в темноте при 4 градусах Цельсия перед CLSM-визуализацией. Для CLSM-визуализации и анализа используйте объектив 63 X для генерации 97 стеков на изображение с интервалом 0,21 микрона на стек.