Выделение внутриклеточных патогенных бактерий из инфицированных клеток хозяина

Возьмём суспензию патогенных бактерий.

Добавьте суспензию в приклеенную культуру макрофагов или клеток BMDM, полученных из костного мозга, и инкубируете.

Бактерии используют свои поверхностные белки для связывания с рецепторами клеток хозяина, что способствует их прикреплению.

Прополосните буфером, чтобы удалить не прилипшие бактерии.

Добавьте свежие материалы и инкубируете.

Прилипшие бактерии затем внутрь поглощаются клетка-хозяином.

Добавьте антибиотик для уничтожения неинтернализированных бактерий.

Сбросьте медиа и смойте с помощью буфера.

Добавьте охлаждённую воду, чтобы лизировать клетку-хозяина, высвобождая содержимое клеток, ядро и внутренние бактерии.

Соберите лизат клетки и центрифугите для осаждения клеточных обломков.

Соберите супернатант, содержащий бактерии. Пропустите его через фильтрационное устройство для захвата целых бактерий.

Сложите фильтрующую бумагу и положите её в трубку.

Мгновенная заморозка в жидком азоте для сохранения целостности клетки.

Храните в холодных условиях для дальнейшего использования.

Используя 0,5 миллилитра промытой бактериальной суспензии, инфицируйте каждую пластину макрофага. Если используете несколько пластин, размещайте инфекции с интервалом в 15 минут, чтобы можно было собирать каждую пластину по отдельности в конце инфекции. После 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия используйте PBS, чтобы дважды промыть инфицированные клетки и удалить отключённые бактерии, а затем добавьте 30 миллилитров предварительно нагретой BMDM-среды.

Инкубировать 30 минут, чтобы бактерии могли внутреннее рассеяться. Через час после заражения добавьте гентамицин в конечную концентрацию 50 микрограммов на миллилитр, чтобы уничтожить оставшиеся внеклеточные бактерии. Собрать фильтрующий аппарат, разместив фильтрующую головку на колбу для сбора жидкости с вакуумным выходом.

Затем установите фильтр диаметром 0,45 микрона на головку фильтра, затем воронку цилиндра и используйте металлический зажим для закрепления различных частей. Через шесть часов после заражения осмотрите монослой клетки под микроскопом перед сбором. Работая с одной тарелкой за раз для сбора бактерий, используйте PBS для промывки заражённых клеток.

Затем, чтобы лизировать клетки макрофагов, добавьте 20 миллилитров ледяной воды без РНК и быстро, но аккуратно используйте скребок клеток, чтобы соскребать клетки с пластины. После сбора клеток в коническую трубку объёмом 50 миллилитров, проведите вихрь в течение 30 секунд, затем центрифугайте при 800 g и 4 градусах Цельсия в течение 3 минут, чтобы удалить ядра макрофаговых клеток. Для сбора бактерий пропустите супернатант через фильтр с помощью вакуумной системы.

Затем, с помощью пинцета, скрутите фильтр и быстро переведите его в коническую трубку объёмом 15 миллилитров. Немедленно используйте жидкий азот, чтобы резко заморозить трубку.