Микрофлюидное устройство для съёмки в реальном времени и отслеживания давления во время формирования биопленки

Начните с микрофлюидного устройства, установленного на стадии микроскопа.

Устройство состоит из полимерно-стеклянной сборки, окружающей микроканал с цилиндрическими стойками, имитирующими пористую среду.

Шприцовый насос подаёт культурную среду через фильтрованный шприц в канал, который через выходную трубку сливается в контейнер для отходов.

Контролируйте базовое давление жидкости с помощью датчика, подключённого к каналу.

Поместите выходную трубку в флакон с бактериальной суспензией.

Обратите поток назад, пока суспензия не заполнит канал, в то время как фильтр предотвращает проникновение бактерий в шприц.

Инкубировать так, чтобы бактериальные клетки могли прилипнуть к поверхностям, размножаться и инициировать образование биопленки.

Затем снимите фильтр и верните выход в контейнер для отходов.

Возобновите поток среды и контролируйте давление по мере роста биопленки и блокировки канала.

Зафиксировать микроскопические изображения с таймлапсом для визуализации роста биопленки со временем. Сопоставьте рост биопленки с изменением давления для изучения биозакупорки в пористых средах.

Начните с включения коробчатого инкубатора микроскопа за три часа до начала эксперимента, чтобы обеспечить стабильную температуру 25 градусов Цельсия.

Подключите впускную и выходную трубку к микрофлюидному устройству. Закрепите соединение между трубкой и шприцем, вставив иглу внешнего диаметра 0,6 миллиметра в впускную трубку. Поместите микрофлюидное устройство, 30 миллилитров деионизированной воды и 30 миллилитров культурной среды в вакуумный десикатор и дегазируйте их не менее одного часа.

Когда всё готово, медленно перетяните посевную среду и деионизированную воду в два отдельных шприца по 30 миллилитров. Затем установите микрофлюидное устройство на микроскоп и поместите выходную трубку в контейнер для отходов. Подключите шприц, наполненный деионизированной водой, к микрофлюидному каналу через микрофлюидную трубку и медленно вводите воду, пока она не выйдет из выхода датчика давления.

Наполните датчик давления водой и промите все пузырьки из трубки, соединяющей микрофлюидный канал и датчик давления. Закройте выход датчика давления винтами, предназначенными для датчика давления. Заполните остальную часть микрофлюидного канала деионизированной водой.

Далее поставьте фильтр 1,2 микрометра на шприц с культурной средой. Снимите водяной шприц и аккуратно подключите шприц к входной микрофлюидной трубке. После установки шприца на насос промывайте канал культурной средой с расходом два миллилитра в час в течение одного часа.

После этого настройте шприцовый насос на желаемый расход во время эксперимента и установите давление датчиков на нуле. Далее — пипетка 1 миллилитра культуры Bacillus subtilis NCIB 3610 с оптической плотностью 0,1 при длине волны 600 нанометров в флакон центрифуги объёмом 1,5 миллилитра. Чтобы загрузить бактериальную культуру в микрофлюидный канал, поместите выходную трубку в флакон центрифуги и подождите пять минут, чтобы удалить возможные воздушные пузырьки из выхода трубки.

После завершения убрать 150 микролитров бактериального раствора со скоростью потока 1 миллилитр в час, пока микрофлюидный канал не заполнится бактериальной культурой. Затем аккуратно снимите фильтр для шприца и поставьте его в контейнер для отходов. Оставьте бактериальные клетки в условиях нулевого потока в микрофлюидном канале на три часа, чтобы позволить им прикрепиться к поверхности в пористой среде.

Для начала эксперимента запустите поток, установив шприцовый насос на желаемую скорость расхода и измерив давление на 1 герц, прежде чем получить изображения растущих биопленок в нужный временной интервал, оптическую конфигурацию и увеличение.