Иммунокрашивание микропоражений, наполненных бактериями, в срезе сердечной ткани мыши для визуализации

Начните с слайда с химически фиксированным срезом сердечной ткани мыши, инфицированной Streptococcus pneumoniae, патогенной бактерией.

Эта инфекция вызывает образование внеклеточных, наполненных бактериями микропоражений в сердечных мышцах.

Промой участок буфером, чтобы удалить остатки фиксативного средства.

Нанесите неионный детергент для проницаемости клеточных мембран хозяина.

Постирайте ещё раз, чтобы убрать остатки моющего средства.

Инкубировать секцию блокирующим агентом для блокировки неспецифических сайтов связывания.

Прополоскайте, чтобы удалить незавязанный блокирующий агент.

Введите первичное антитело, которое связывается с капсулярным полисахаридом бактерий.

Промыйте для удаления несвязанных антител, затем добавьте зелёное вторичное антитело, маркированное фторфором, которое связывается с первичным антителом.

Контрокрашивание ядерным красителем для маркировки ядер клеток хозяина.

Промыйте участок и закрепите с помощью монтажного материала.

Изучайте участок с помощью конфокальной микроскопии, чтобы визуализировать помеченные бактерии внутри микропоражений.

Используя 5-микронную кардиологическую секцию на положительно заряженных стеклянных стеклах, сначала заморозьте секции, затем разморозьте их и дайте высохнуть на воздухе. Закрепите стекли в формалине с нейтральным буфером 10% на 10 минут при 25 градусах Цельсия. Затем снимайте фиксатор тремя размывами и используйте PBS на пять минут за одну стирку.

Затем пермеабилизуйте ткань с помощью 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 15 минут. Удалите моющее средство ещё тремя стирками в прямом PBS. Затем заблокируйте ткань 10% козьей сывороткой в PBS на час. После промывания в PBS накройте участок антисывороткой на два часа при 37 градусах Цельсия. Лечите негативные контроли наивным антисывороткой.

Поскольку сердечная ткань легко поглощает XI иммунофлуоресцентную окраску, что приводит к высоким фоновым уровням, концентрация в инкубационном времени для различных типов антител, вероятно, потребуется оптимизировать.

Через два часа смойте антисыворотку с помощью PBS. Затем замените раствор вторичным антителом и дайте стеклам инкубироваться при 37 градусах Цельсия ещё 30 минут. Теперь нанесите DAPI по 5 миллиграммам на миллилитр и промой стекли PBS. Наконец, установите слайды в FluorSave и сделайте изображение с помощью конфокальной микроскопии.