Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 2:33 мин. • February 26th, 2026
Начните с пластин, содержащих поверхностно прикреплённые бактерии и планктонные или свободно плавающие бактерии.
Добавьте клетки амёбы в оба образца.
Положите на каждый образец агарозную прокладку с кальцеином-AM — клеточно-проницаемым красителем.
Удалите лишнюю жидкость, дайте высохнуть и инкубуйте тарелки.
В пластине с поверхностно прикреплёнными бактериями поверхностный контакт усиливает гены вирулентности, экспрессируя токсины.
Эти токсины нарушают оболочку амёбы и меняют её форму.
Повреждённая мембрана амёбы позволяет большему числу кальцеина-AM попадать в цитоплазму, где внутриклеточные эстеразы расщепляют их в флуоресцентный кальцеин, что приводит к его накоплению.
В отличие от этого, планктонные бактерии, не имеющие контакта с поверхностью, остаются невирулентными, оставляя мембраны амёб нетронутыми. Это снижает попадание кальцеина-AM в амёбу, ограничивая накопление флуоресцентного кальцеина.
Здоровые амёбы также поглощают невирулентные бактерии.
Под флуоресцентным микроскопом яркие, округлые клетки амёбы указывают на вирулентное бактериальное взаимодействие, тогда как тусклые, аморфные амёбы указывают на невирулентное бактериальное взаимодействие.
Для анализа вирулентности поверхностно прикреплённых бактериальных клеток добавьте 10 микролитров клеток амёбы из ранее полученных поверхностно прикреплённых бактериальных клеток.
Для выделения планктонных клеток перенесите 10 микролитров культуры в свежую чашку Петри.
Далее проверьте вирулентность планктонных клеток, смешивая 10 микролитров клеток амёбы с ранее полученными планктонными бактериями.
Сразу положите маленькую агарную подушечку поверх соответствующей смеси бактерий и амеб на поверхности чашки Петри.
Затем удалите лишнюю жидкость, аккуратно наливая её пипетом, и дайте блюду высохнуть 20 минут.
Накройте блюдо крышкой и инкубируете при комнатной температуре ещё 40 минут. Наконец, используйте флуоресцентный микроскоп для получения изображений как минимум 100 клеток амёбы.