Оценка влияния ингибиторов на образование пелликул у Bacillus subtilis

Начните с культуры Bacillus subtilis — почвенной бактерии, выращенной в питательной среде.

Центрифуга для гранулирования бактерий, сбросьте супернатант, затем снова суспензируйте гранулу в химически определённой среде, поддерживающей образование биопленки.

Измерьте оптическую плотность культуры, чтобы определить соответствующую концентрацию бактерий.

Добавляйте культуру в колодцы с определённой средой для контроля и определённой средой с ингибитором для теста.

Инкубировать в статических условиях. Бактерии мигрируют вверх и накапливаются на границе воздух-жидкость, где повышенная доступность кислорода способствует росту бактерий.

В контрольной яме бактерии на интерфейсе выделяют компоненты внеклеточного матрикса и образуют плавающую биоплёнку, известную как пелликула — защитный слой, повышающий выживание бактерий.

В испытательной яме ингибитор нарушает синтез матрицы, что приводит к рассеиванию бактериальных популяций.

Этот анализ показывает, что ингибиторы блокируют образование биопленки, что является ключевой особенностью бактериального патогенеза.

Сначала выберите подходящую одну колонию и пересадите её в 3 миллилитра бульона LB. Поместите эту стартовую культуру в трясущий инкубатор на 4 часа при 37 градусах Цельсия. После инкубации возьмите 1,5 миллилитра заквасковой культуры и центрифугуйте в течение четырёх минут.

Аккуратно удалите супернатант, а затем снова суспензуйте гранулу в 1,5 миллилитрах среды MSgg. Для выращивания пелликул подготовьте 12-колодную клеточную культивационную пластину, добавив 3 миллилитра MSgg в каждую яму. К некоторым из этих скважин добавьте MSgg с малым молекулярным ингибитором в концентрационном диапазоне, распределяя расположение разных концентраций по антенне, чтобы избежать эффектов по краям.

Измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах повторно взвешенной стартерной культуры. Культура должна быть от 0,6 до 1. Это критически важно для устойчивости системы.

Инокулируйте каждую ямку посевной пластины 3 микролитрами повторно суспензированной стартовой культуры. Затем инкубировать пластину при 23 градусах Цельсия в течение трёх дней в статических условиях. Затем вынимите пластину из инкубатора и осмотрите пелликулы.