Анализ устойчивости на этанол для оценки целостности матрицы биопленки

Возьмём биопленки, полученные от патогенных бактерий, выращенные на питательном агаре.

Необработанная биопленка содержит плотно упакованные бактерии в защитном внеклеточном матриксе.

Обработанная ингибиторами биопленка содержит слабо связанные клетки в разрежённой матрице.

Разрезать каждую биопленку пополам, затем подвергнуть одну половину буферизации в качестве контроля, а другую — этанолу для создания антимикробного стресса.

В необработанной, подверженной этанолу биоплёнке плотная матрица снижает диффузию этанола и ограничивает проникновение клеток, что приводит к меньшему уничтожению бактерий.

В обработанной ингибиторами биопленке, подвергшейся этанолу, разрежённая матрица позволяет этанолу проникать более легко, что приводит к большему уничтожению бактерий.

Центрифугуйте трубки и удалите супернатант. Добавьте буфер и соник, чтобы рассеять ячеек.

Разбавленные суспензии покройте в пластину и инкубируете, чтобы обеспечить рост жизнеспособных бактерий.

Подсчёт колониообразующих единиц (CFU); Меньшее количество CFU из обработанной ингибиторами и подвергшейся этанолу биопленки подтверждает, что целостность матрицы необходима для устойчивости к этанолу.

Возьмите чистое лезвие бритвы и разрежьте колонии биопленки на две равные части с помощью шаблона. Аккуратно поднимите одну половину колонии чистой лопаткой и перенесите её в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра, содержащую 500 микролитров PBS.

Возьмите вторую половину колонии и перенесите её в микроцентрифугную трубку с 500 микролитрами этанола 50%. Они будут использоваться для оценки устойчивости к стерилизующим агентам. Затем аналогично возьмите первую половину колонии, обработанной D-лейцином, и поместите её в PBS.

Затем возьмите вторую половину этой колонии и переведите её на этанол. Инкубировать все трубки с половинами биопленки в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем центрифугуйте их пять минут при 18 000 раз на g.

С помощью пипетки аккуратно удалите супернатант. Добавьте 300 микролитров PBS, а затем соникизируйте клетки на низкой частоте с помощью микротип-соникатора. Добавьте дополнительно 700 микролитров PBS для итогового объёма в один миллилитр.

Затем выполните последовательное разбавление на 10 до минус семи в PBS. Возьмите 100 микролитров одного из разбавлений и инокулируйте 1,5% пластину Agar LB. Повторите этот шаг для двух других разбавлений на образец.

Размазывайте инокулюм стеклянными бусинами, а затем инкубируете тарелки на ночь при 30 градусах Цельсия. Изучите пластины и подсчитайте колониообразующие единицы (CFU). После расчёта значения CFU на миллилитр рассчитайте процент выживших в PBS по сравнению с этанолом.