Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 2:32 мин. • February 26th, 2026
Инкубировать камерное стекло с прилипшими бактериями в среде с добавлением фильтрата мокроты, полученной пациентами при муковисцидозе, и только в этой среде.
Фильтрат мокроты содержит компоненты, полученные от хозяина, которые стимулируют бактериальные сигнальные пути, стимулируя образование матрицы и формирование биопленки.
После образования биопленок отбрасывайте среду, содержащую свободно плавающие бактерии и остаточные компоненты, производные от хозяина.
Мойте с помощью буфера, чтобы удалить слабо прикреплённые бактерии.
Добавьте окрашивающую смесь, содержащую мембранопроницаемые и мембранно непроницаемые флуоресцентные красители, и инкубуйте в темноте.
Мембранопроницаемый краситель пересекает целые мембраны, помечая как жизнеспособные, так и нежизнеспособные бактерии. В отличие от этого, непроницаемый краситель попадает только в повреждённые мембраны, избирательно маркируя нежизнеспособные бактерии.
После инкубации удалите раствор для окрашивания и смойте буфером, чтобы удалить избыток красителя и уменьшить фоновый флуоресцентный эффект.
Добавьте свежий носитель и получите изображения с помощью конфокальной микроскопии.
Биопленки, выращенные с помощью фильтрата мокроти, имеют увеличенную толщину, что подчёркивает роль компонентов, полученных от хозяина, в формировании биопленки.
После выращивания удалите среду из колодцев камеры и аккуратно промыйте каждую камеру дважды 300 микролитрами стерильного PBS.
Далее, чтобы подготовить смесь для окрашивания биопленки, добавьте 1 микролитр каждого красителя из комплекта жизнеспособности к каждому миллилитру раствора и перемешайте раствор.
Оптимальное время окрашивания и окрашивания определяется эмпирически для каждого организма.
Добавьте 200 микролитров окрашивающей смеси в каждую ячейку камерного крышного стекла. Инкубировать стекло на крышке.
После инкубации удалите окрашивающую смесь из камер и промыйте каждую колодцу 300 микролитрами стерильного PBS.
Замените PBS на свежие носители. Наконец, приступайте к визуализации с помощью конфокальной микроскопии.