Подготовка образцов и визуализация флуоресцентно маркированных бактерий

Начните с большого стеклянного стекла, с меньшими стеклянными стеклами, размещёнными по обоим краям в двойном слое.

Налейте расплавленную агарозу в пространство и накройте его большим стеклянным слайдом.

Охладите установку, чтобы агароза затвердела.

Снимите стеклянные стекла и разрежьте агарозу на маленькие подушечки.

Поместите агарозные подушки внутрь клейкой рамки, прикреплённой к слайду.

Возьмите культуру патогенных бактерий, генетически модифицированных для экспрессии флуоресцентно маркированной системы секреции, необходимой для инфекции хозяина.

Используйте плотный бактериальный пластырь и подвесьте его в воде.

Вихрь для равномерного распределения бактерий.

Нанесите подвеску на агарозную подушечку, чтобы обездвижить бактерии.

Герметизируйте с помощью coverslip для поддержания гидратации.

При ярком освещении выберите поле ячеек для съёмки.

Оптимизируйте настройки микроскопа для уменьшения фотоотбеливания и повышения чувствительности сигнала.

Переключитесь на флуоресцентный канал для обнаружения флуоресцентно помеченных бактерий.

Начните с изготовления агарозных площадок для живых клеточных визуализации. Приготовьте примерно 30 миллилитров 1% раствора агарозы с низким содержанием талого в воде и разогрейте в микроволновке в стеклянной колбе около 90 секунд, время от времени поворачивая, пока агароза полностью не растворится.

Поставьте две стеклянные стеклянные стекла размером 22 на 22 на 0,15 миллиметра на краю стеклянного стекла размером 25 на 75 на 1,1 миллиметра, одна поверх другой. Затем положите ещё два маленьких слайда на другом краю. Пипетте около 1 миллилитра расплавленной агарозы в центральное стекло между двумя верхними стеклянными стеклянными стеклянными стеклами и поставьте ещё один большой слайд поверх расплавленной агарозы, чтобы избежать образования воздушных пузырьков.

Охладите слайды при 4 градусах Цельсия в течение 15 минут, затем скальпелем или лезвием аккуратно нарежьте подушечку на маленькие квадраты. Закрепите двухстороннюю клейкую рамку на стеклянном затворе размером 25 на 75 на 1,1 миллиметра и установите несколько подушек на затвор. Растворите плотный участок легионеллы пневмофилы в 1 миллилитре двойной дистиллированной воды.

Затем вихрь и пипетка 2–3 микролитра разбавления на площадки. Аккуратно наденьте крышку размером 58 на 24 на 0,15 миллиметра на клейкую рамку. Выберите ячейки для съёмки с помощью яркого освещения.

Затем, в окне захвата программного обеспечения микроскопа, отрегулировать ND на 180 и биннинг на 2 на 2. Используйте канал диаметром 488 нанометров, чтобы экспонировать образец на 500–1000 миллисекунд и проверить специфичность флуоресценции, сфотографировав немаркированную Legionella pneumophila с теми же параметрами.