Количественная оценка Clostridium difficile в образцах кала из модели инфицированных мышей

Начнём с мыши, у которой желудочно-кишечный тракт колонизируется Clostridium difficile — анаэробным спорообразующим бактериальным патогеном.

Удержите мышь и дайте ей естественным образом испражниться в стерильную, заранее взвешенную трубку.

Определите чистый вес образца фекалий, вычитая вес пустой пробирки из общего веса, чтобы подготовить соответствующие разбавления.

Переместить образец в анаэробную среду для сохранения жизнеспособности кислородочувствительной бактерии.

Добавьте буфер к образцу и механически нарушите его, чтобы выпустить содержимое в суспензия.

Инкубировать так, чтобы крупные обломки осели, сохраняя бактериальные клетки и споры в наднатерянном.

Проведите последовательные разбавления супернатанта в буфере.

Разбавляйте на селективные среды и инкубируют в анаэробных условиях.

Среда способствует прорастанию спор и селективному росту Clostridium difficile , одновременно подавляя конкурирующие бактерии, что приводит к образованию отдельных колоний.

Подсчитайте колонии для количественной оценки нагрузки Clostridium difficile в фекалиях и оцените колонизацию желудочно-кишечного тракта.

Чтобы собрать образцы фекалий у мышей для оценки, сначала слегка, но твёрдо удерживать мышь за обвисшую кожу на шее и спине, чтобы животное не находилось в стрессе.

Мизинцем аккуратно поднимите хвост животного, обнажая анус. Поддержите стерильную микроцентрифугу известного веса прямо под анусом животного, чтобы трубка не касалась мыши напрямую. Когда животное испражняется, собирайте фекальные гранулы в трубку.

Храните пробирку при комнатной температуре до сбора всех необходимых образцов. Взвесьте пробирки с фекалиями на аналитических весах и запишите массу до четырёх знаков после запятой. Вычислите вес фекальной гранулы, вычитая вес трубки.

Далее вычислите разбавление содержимого от одного до десяти и повторно подвесьте до 1x PBS. Используйте кончик пипетки, чтобы аккуратно разбить фекальные вещества в раствор. Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 30 минут, давая содержимому осесть.

Поддерживая растворы анаэробным способом, выполняйте последовательные разбавления для каждого образца в 1x PBS. Перенесите 100 микролитров каждого последовательного разбавления на пластины TCCFA. Используйте стерильный L-образный распределитель и равномерно наносите среду на пластины.

Инкубировать пластины в анаэробных условиях при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. Наконец, перечислите колонии C. difficile и рассчитайте единицу содержания фекалий, формирующую колонию на грамм.