Флуоресцентный анализ для изучения взаимодействия макрофаг-рецепторов с бактериальными антигенами

Начните с красного фторофора с маркировкой M. Антигены туберкулёза иммобилизованы на покрытом полимером покрытии покрытия.

Добавьте блокирующий буфер для блокировки неспецифических сайтов связывания. Помойте, чтобы удалить лишний блокатор.

Ввести тотальный белок, извлеченный из человеческих макрофагов, включающий интересующий клеточный поверхностный рецептор. Инкубация.

Макрофаговые рецепторы связываются с иммобилизованными бактериальными антигенами.

Добавьте кросс-сшиватель для стабилизации рецептор-антигенных комплексов, а затем гаситель для нейтрализации нереагируемых перекрёстных сшивателей.

Промыйте и добавьте второй сшиватель для усиления комплексов.

Постой снова. Затем снимите покровитель и переверните его поверх раствора первичного антитела.

Антитела связываются с интересуемым макрофагным рецептором.

Промыйте и переверните покрытие на зелёный вторичный антител, конъюгированный с фторофором, который связывается с первичными антителами.

Стирайте и крепите накладку.

Визуализируйте образец под флуоресцентным микроскопом. Совместные локализованные красные и зелёные сигналы подтверждают взаимодействие между макрофаговым рецептором и бактериальным антигеном.

С помощью круглоносых хирургических пинцетов поместите 12-миллиметровые круглые крышки в колодцы 24-колодцевой посевной пластины.

Инкубировать покрытие антигенами родамина Mycobacterium tuberculosis в течение 1 часа при 37 градусах Цельсия. После инкубации добавьте 100 микролитров белкового экстракта, разбавленного в 300 микролитрах PBS, и инкубуйте 2 часа при комнатной температуре с перемешиванием. Обмотайте крышку тарелки для культуры керофиновой пленкой.

Добавьте 60-литровую каплю ранее титрированного первичного антитела против SLAMF1 на крышку, покрытую парафиновой пленкой. Аккуратно снимите крышку с пластины с помощью изогнутых хирургических пинцетов и игл. После инкубации с первичным и вторичным раствором антител удалите лишнюю жидкость и закрепите накладку на каплю монтажной жидкости, размещённой на стеклянном стекле. Поместите стекло под флуоресцентный микроскоп и осмотрите клетки с помощью соответствующих фильтров.