JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 3:03 мин • March 31st, 2026
Возьмите бактериальную культуру, способную заражать ткани листьев.
Соскребли колонии и подвесьте в соленом растворе.
Измерьте оптическую плотность для оценки концентрации бактерий, затем разведите до желаемого OD.
Проведите серийное разбавление для достижения конечной концентрации инокуля.
Добавьте поверхностно-активное вещество для снижения поверхностного натяжения и обеспечения равномерного распространения бактерий на листе.
Перенесите подвеску на чашку Петри.
Затем положите две деревянные палочки на верхнюю часть горшка для арабидопсиса .
Переверните растение поверх блюда, погружая листья в подвеску.
Поместите установку в вакуумную камеру и примените вакуумный импульс
Приложенный вакуум удаляет воздух из ткани листьев через естественные отверстия.
Освобождение вакуума восстанавливает атмосферное давление, заставляя бактерии попадать в листья.
Повторяйте импульсы для максимальной инфильтрации.
Достань кастрюлю. Затем промокните лишний инокулум.
Листья, заражённые бактериями , Arabidopsis готовы к дальнейшему анализу.
Очистите глицероловый запас интересующего штамма Pseudomonas syringae с минус 80 градусов Цельсия в LB-пластину с соответствующими антибиотиками. Инкубировать пластину при 28 градусах Цельсия в течение 40–48 часов. Соскребли бактериальную биомассу и суспензируют её в пяти миллилитрах 10-миллимолярного хлорида магния.
Измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах и отрегулируйте до 0,1, добавив 10-миллимолярный хлорид магния. Проведите серийное разбавление 10-миллимолярным хлоридом магния, чтобы получить конечную концентрацию инокуля 5 умножить на 10–5 CFU на миллилитр. Затем подготовьте 200 миллилитров инокулума для растений Arabidopsis и 50 миллилитров для бобовых растений.
Перед вакцинацией добавьте поверхностно-активное вещество Silwet L-77 к конечной концентрации 0,02% для инокуляции из бобов и 0,01% для Arabidopsis. Для инфильтрации арабидопсиса положите две деревянные палочки, образующие букву X, поверх горшка и поставьте горшок вниз на чашку Петри диаметром 14 сантиметров, содержащую 200 миллилитров инокулума. Для инокуляции листьев бобов поместите растения и раствор инокулума в вакуумную камеру и введите лист в 50-миллилитровую коническую центрифугную трубку с инокулумом.
Дайте импульс 500 миллибар в течение 30 секунд, чтобы проникнуть в листья. Сливайте лишний раствор инокулюма с помощью бумаги и возвращайте растения в соответствующую камеру роста.