Высокопроизводительная визуализация внутриклеточной инфекции Brucella abortus в эпителиальных клетках хозяина
JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 3:43 мин • March 31st, 2026
Начните с эпителиальных клеток, в которых экспрессия интерферонного адаптерного белка, ключевого посредника врожденного иммунитета, была снижена, что делает клетки более восприимчивыми к инфекции Бруцеллой .
Замените среду на инфекционную среду, содержащую зелёный флуоресцентный белок, экспрессирующий Brucella abortus, факультативный внутриклеточный патоген, в нужной концентрации.
Центрифугуйте пластину для стимулирования контакта между бактериями и клетками хозяина, затем инкубируют для внутренней интернализации бактерий.
Промывайте клетки средой с сывороткой и обработайте их антибиотиком для уничтожения внеклеточных бактерий.
Инкубировать дальше, чтобы Brucella могла размножаться внутриклеточно.
Промыйте клетки буфером и закрепите их параформальдегидом для сохранения внутриклеточных структур.
Смойте лишний фиксатор. Затем добавьте буфер с детергентом для проницаемости клеток.
Смойте остаточное моющее средство, затем добавьте DAPI, чтобы окрасить ядра и выполните финальную промывку.
С помощью автоматического микроскопа получите высокопроизводительные изображения инфекции Бруцеллой в эпителиальных клетках хозяина.
Используя автоматическую мойку пластин, замените трансфекционную среду на 50 микролитров инфекционного материала. Внутри капюшона переместите пластину в центрифугную клетку и центрифугуйте пластину с 384 лунками при 400 g и 4 градусах Цельсия в течение 20 минут.
Затем используйте парапленку, чтобы запечатать пластину и инкубировать её на предварительно нагретой алюминиевой пластине при температуре 37 градусов Цельсия и 5%CO2 в течение четырёх часов. После инкубации с автоматической мойкой используйте DMEM с 10% FCS, содержащим 100 микрограммов на миллилитр гентамицина или ГМ, чтобы промыть клетки и инактивировать внеклеточные бактерии. Затем используйте парапленку для герметизации пластины и поставьте её обратно на предварительно нагретую алюминиевую пластину в инкубаторе ещё на 40 часов для конечного анализа.
Чтобы починить клетки, сначала используйте PBS для промывки колодцев. Затем замените PBS на 50 микролитров PFA 3,7% в 0,2 молярах HEPES при pH 7,4 и инкубируют клетки при комнатной температуре в течение 20 минут.
После инкубации используйте 50 микролитров PBS для замены фиксационной среды. Для окрашивания образцов автоматической мойкой пластин начните с использования 50 микролитров 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут для пермеабилизации клеток.
После трёхкратной промывки клеток с помощью PBS добавьте 50 микролитров PBS с одним микрограммом на миллилитр DAPI и инкубируете при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем используйте PBS, чтобы три раза промыть клетки, прежде чем защитить их от света. Перенесите пластину в автоматический микроскоп.
Обзор
В данном протоколе описан метод высокопроизводительной визуализации внутриклеточной инфекции Brucella abortus в эпителиальных клетках хозяина. Он позволяет исследователям визуализировать и анализировать процесс инфицирования, что способствует более глубокому пониманию патогенеза Brucella.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Взаимодействие патогена и хозяина
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Brucella abortus является факультативным внутриклеточным патогеном.
- Понимание механизмов его инфекции имеет решающее значение для разработки терапевтических стратегий.
- Высокопроизводительная визуализация позволяет проводить масштабные исследования динамики инфекции.
- Восприимчивость клеток хозяина можно регулировать путем снижения факторов врожденного иммунитета.
Цель исследования
- Для визуализации процесса внутриклеточной инфекции Brucella abortus.
- Для оценки влияния факторов клеток хозяина на восприимчивость к инфекции.
- Для предоставления надежного метода изучения бактериального патогенеза.
Используемые методы
- Инфицирование эпителиальных клеток Brucella abortus, экспрессирующей GFP.
- Использование антибиотиков для элиминации внеклеточных бактерий.
- Высокопроизводительная визуализация с помощью автоматизированной микроскопии.
- Фиксация и окрашивание клеток для визуализации ядер.
Основные результаты
- В данном протоколе представлены этапы подготовки и визуализации инфицированных клеток.
- В нем описано использование специфических реагентов и условий для достижения оптимальных результатов.
- Высокопроизводительная визуализация позволяет анализировать несколько образцов одновременно.
- Результаты могут дать представление о внутриклеточном поведении Brucella abortus.
Выводы
- Данный метод позволяет детально наблюдать за инфекцией Brucella в клетках хозяина.
- Он может быть использован для изучения влияния различных методов лечения на динамику инфекции.
- Этот подход может помочь в разработке новых терапевтических вмешательств.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол высокопроизводительной визуализации позволяет систематически исследовать взаимодействия между хозяином и патогеном в моделях внутриклеточных бактериальных инфекций. Путем количественного определения репликации Brucella abortus в эпителиальных клетках при заданных генетических пертурбациях данный метод способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в программах разработки антимикробных препаратов. Формат анализа обеспечивает прогностическую достоверность для приоритизации терапии, направленной на клетки хозяина, и усилий по поиску перспективных соединений-лидеров с учетом конкретных сигнальных путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Проверка терапевтических гипотез путем установления связи между путями сенсинга цитозольной ДНК и фенотипами внутриклеточной репликации бактерий.
- Практическая ценность: Обеспечение функциональной валидации мишеней посредством siRNA-опосредованного нокдауна медиаторов врожденного иммунитета, таких как STING.
- Прогностическая ценность: Поддержка приоритизации портфеля препаратов путем количественной оценки динамики инфекции при контролируемой модуляции факторов хозяина.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных систем эпителиальных клеток для последующего скрининга соединений или генетического скрининга.
- Операционная ценность: Стандартизация показателей инфекции с помощью автоматизированной микроскопии и количественного отслеживания патогенов, экспрессирующих GFP.
- Ценность масштабируемости: Обеспечение возможности повторного использования платформы в форматах с 384 лунками для высококонтентного скрининга факторов хозяина.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: обеспечивает соответствие патологии заболевания путем моделирования эпителиальной инфекции Brucella, что является ключевым этапом зоонозного патогенеза.
- Преклиническая преемственность: связывает механизмы ранних открытий с их валидацией в физиологически релевантных контекстах клеток хозяина.
- Принятие решений с учетом рисков: определяет критерии дальнейшего продвижения, выявляя зависимости от хозяина, которые критически важны для внутриклеточного выживания.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки — от проверки гипотез о мишенях и идентификации соединений-лидеров до доклинической валидации механизмов действия, что особенно актуально для программ изучения внутриклеточных патогенов.
- Открытия в биологии: Помогает в проверке гипотез о факторах хозяина, влияющих на интернализацию и репликацию патогенов.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных рабочих процессов инфицирования, селекции антибиотиками и фиксации.
- Аналитика: Позволяет проводить количественную оценку внутриклеточной нагрузки патогенов с помощью сигнала GFP и ядерного ко-окрашивания для анализа отдельных клеток.
- Трансляционные исследования: Связывает модуляцию путей врожденного иммунитета с исходами инфекции, что способствует валидации механизмов на основе биомаркеров.
- Повторное использование в масштабах предприятия: Создает многоразовую платформу визуализации, применимую к другим внутриклеточным бактериям или вирусам с флуоресцентными репортерами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность во взаимодействии хозяина и патогена за счет изоляции конкретных вкладов врожденного иммунитета.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет автоматизированного дозирования жидкостей, стандартизированной инкубации и визуализации с фиксированной конечной точкой.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем количественной оценки фенотипов инфекции на ранних этапах валидации мишени.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию антиинфекционных препаратов, нацеленных на хозяина, с учетом рисков на основе данных о генетической зависимости.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, трансфекцией и внутриклеточными патогенами в условиях уровня биобезопасности BSL-2.
- Метод зависит от инфраструктуры автоматизированной микроскопии, способной осуществлять регистрацию сигналов GFP и DAPI в формате 384-луночных планшетов.
- Необходима межкомандная стандартизация времени инфицирования, подбора антибиотиков и протоколов фиксации.
- Адаптация метода для первичных или дифференцированных эпителиальных моделей может потребовать оптимизации эффективности инфицирования и контроля токсичности.
- Практические ограничения включают зависимость от флуоресцентных штаммов патогенов и возможную вариабельность эффективности трансфекции между лунками.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Высокая пропускная способность, в режиме реального времени, двойного считывания Тестирование внутриклеточного антимикробной активности и эукариотической клетки цитотоксичность
Похожие видео
0 Просмотры
Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул
Похожие видео
0 Просмотры
Разработка анализа для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов против микобактерий
Похожие видео
0 Просмотры
В режиме реального времени Визуализация лейкотриена B 4 Опосредованного миграции клеток и BLT1 Взаимодействие с β-arrestin
Похожие видео
0 Просмотры
Мониторинг Иммунные клетки торговли Флуоресцентный Прион стержни часов после внутрибрюшинного инфекции
Похожие видео
0 Просмотры
Визуализация InlC секрецию по расследованию сотовой инфекции по бактериальным патогеном
Похожие видео
0 Просмотры
Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием
Похожие видео
0 Просмотры
Высоко Решено Прижизненные Полосатый-подсветка микроскопия зародышевых центров
Похожие видео
0 Просмотры
Микроскопия основе Анализы для высокопроизводительного скрининга на хост факторов, участвующих в
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция одной внутриклеточных бактериальных сообществ, генерируется из мышиных модели инфекции мочевыводящих путей анализа течению одноклеточного
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026