Высокопроизводительная визуализация внутриклеточной инфекции Brucella abortus в эпителиальных клетках хозяина

Начните с эпителиальных клеток, в которых экспрессия интерферонного адаптерного белка, ключевого посредника врожденного иммунитета, была снижена, что делает клетки более восприимчивыми к инфекции Бруцеллой .

Замените среду на инфекционную среду, содержащую зелёный флуоресцентный белок, экспрессирующий Brucella abortus, факультативный внутриклеточный патоген, в нужной концентрации.

Центрифугуйте пластину для стимулирования контакта между бактериями и клетками хозяина, затем инкубируют для внутренней интернализации бактерий.

Промывайте клетки средой с сывороткой и обработайте их антибиотиком для уничтожения внеклеточных бактерий.

Инкубировать дальше, чтобы Brucella могла размножаться внутриклеточно.

Промыйте клетки буфером и закрепите их параформальдегидом для сохранения внутриклеточных структур.

Смойте лишний фиксатор. Затем добавьте буфер с детергентом для проницаемости клеток.

Смойте остаточное моющее средство, затем добавьте DAPI, чтобы окрасить ядра и выполните финальную промывку.

С помощью автоматического микроскопа получите высокопроизводительные изображения инфекции Бруцеллой в эпителиальных клетках хозяина.

Используя автоматическую мойку пластин, замените трансфекционную среду на 50 микролитров инфекционного материала. Внутри капюшона переместите пластину в центрифугную клетку и центрифугуйте пластину с 384 лунками при 400 g и 4 градусах Цельсия в течение 20 минут.

Затем используйте парапленку, чтобы запечатать пластину и инкубировать её на предварительно нагретой алюминиевой пластине при температуре 37 градусов Цельсия и 5%_CO2 в течение четырёх часов. После инкубации с автоматической мойкой используйте DMEM с 10% FCS, содержащим 100 микрограммов на миллилитр гентамицина или ГМ, чтобы промыть клетки и инактивировать внеклеточные бактерии. Затем используйте парапленку для герметизации пластины и поставьте её обратно на предварительно нагретую алюминиевую пластину в инкубаторе ещё на 40 часов для конечного анализа.

Чтобы починить клетки, сначала используйте PBS для промывки колодцев. Затем замените PBS на 50 микролитров PFA 3,7% в 0,2 молярах HEPES при pH 7,4 и инкубируют клетки при комнатной температуре в течение 20 минут.

После инкубации используйте 50 микролитров PBS для замены фиксационной среды. Для окрашивания образцов автоматической мойкой пластин начните с использования 50 микролитров 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут для пермеабилизации клеток.

После трёхкратной промывки клеток с помощью PBS добавьте 50 микролитров PBS с одним микрограммом на миллилитр DAPI и инкубируете при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем используйте PBS, чтобы три раза промыть клетки, прежде чем защитить их от света. Перенесите пластину в автоматический микроскоп.