Name: Препарирование прав Стекловидное Элементы орган для анализа протеомных (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-23T17:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Узнайте методику диссекции стекловидного тела человека для протеомного анализа. Демонстрируется выделение передней гиалоидной мембраны, базы и коры стекловидного тела с помощью прецизионных инструментов.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Финансирование было предоставлено Борьба за зрение. Ткани были получены из глаз банк Айова Львов.

1. Передняя Dissection сегмента. <ol><li> Роговицы удаляется первый принятия разрез лимба в переднюю камеру использованием 15 ° лезвия (рис. 1). Тогда один лезвие кривизны роговицы, склеры ножницы вставляется в переднюю камеру. Окружная разрезы делаются в роговице, только впереди лимба. </li><li> 0,12 Colibri щипцы и ножницы Уэсткотт используются для сокращения диафрагмы окружности впереди цилиарного тела. </li><li> Объектив ядра удаляется с 0,12 щипцы Колибри или 15 ° лезвия (сверхкоротких) и коре головного мозга и капсулу с пинцета. </li></ol> 2. Стекловидное Стремление Core. <ol><li> 23-иглы на 5-мл шприца вводится в середине стекловидного (рис. 1). </li><li> Примерно в 1 мл или более стекловидное ядро ​​мягко наддува. </li><li> Затем образец помещают в микроцентрифужную трубки, а затем в жидком азоте. </li></ol> 3. Передняя Dissection гиалоидная. <ol><li> Передняя гиалоидная рассматривается как полупрозрачные кольца, регулируя падающего света от световой микроскоп шеи гуся. Предыдущая стремление стекловидное ядро ​​отделяет передние гиалоидная от других структур для облегчения идентификации. </li><li> Лист эластичной ткани, тщательно оторвался от цилиарного тела с Колибри или соус щипцы и вырезать ножницами Vannas. Этот маневр повторяется. </li><li> Затем образец помещают в микроцентрифужную трубки, а затем в жидком азоте. </li></ol> 4. Стекловидное Dissection Base. <ol><li> Использование 0,12 щипцы для стабилизации наглазник, Уэсткотт ножницы используются для «цветок» глаза, сделав четыре равномерно расположенных снятия стресса порезы от цилиарного тела к головке зрительного нерва. </li><li> Plicata Парс из цилиарного тела (рис. 2) удаляется от каждого из квадрантов использованием Уэсткотт ножницами. </li><li> Стекловидного база, то понял по обе стороны от ора Серрата щипцами за Парс Плана и сетчатки (рис. 2). </li><li> Непрерывная тяга на стекловидного базы применяется с щипцами. Последовательная резки с Уэсткотт ножницы экстракты полупрозрачной ткани с "нитка жемчуга" внешний вид, как это вырезали. </li><li> Затем образец помещают в микроцентрифужную трубки, а затем в жидком азоте. </li></ol> 5. Стекловидное Удаление Cortex. <ol><li> Парс Плана иссекается от каждого из квадрантов с ножницами Уэсткотт, сокращая листовки около 3-мм кзади от ора Серрата (рис. 2). </li><li> Между ткани листовки, стекловидное коры себе как полупрозрачные пленки. </li><li> Эластичную пленку, либо захватили с 0,12 щипцов или находящиеся в приверженности Weck-Cel хирургической губки. Стекловидной коры, затем оторвался от сетчатки и вырезали ножницами с Уэсткотт (рис. 1). </li><li> Образец помещается в микроцентрифуге трубки, а затем в жидком азоте. Все образцы хранятся при температуре -80 ° C до использовались для экспериментов. </li></ol> 6. Представитель Результаты Образцы тканей могут быть обработаны различными методами для конкретных экспериментов. В нашем случае, образцы были переданы для анализа белков с помощью ДСН-ПААГ (рис. 3). <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig1.jpg" alt="Рисунок 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 1"> Рисунок 1. Кросс-разрез глаз человека изображающие различные подструктуры стекловидного тела. Самой передней стекловидного представляет собой тонкий слой коллагеновых называют передней гиалоидная. Стекловидное ядро ​​включает в себя всю центральную область стекловидного тела. Эта часть стекловидного более водный, в отличие от стекловидного базы, которая является достаточно вязкой, чтобы быть охваченным щипцов и прочно прикрепляются к базовому цилиарного тела и сетчатки. Охватывая стекловидное ядро ​​очень тонкие коллагеновые оболочки называется стекловидным коры головного мозга. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig2.jpg" alt="Рисунок 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 2"> Рисунок 2. Стекловидное анатомии базы. Стекловидного база полупрозрачные подструктура стекловидного тела, расположенных вдоль ора Серрата (белые стрелки), который является разделительной линией разделения цилиарного тела и сетчатки. Переднему краю стекловидного базы распространяется на Парс-Плана (белая линия) цилиарного тела. Заднему краю стекловидного базы распространяется 2-3-мм кзади от ора Серрата (белый тире). Для акцизного стекловидного базы, щипцы используются для понимания ткани и потяните его от основной цилиарного тела и сетчатки. Как только повышается, Уэсткотт ножницы для резки вдоль основания. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig3.jpg" alt="Рисунок 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 3"> Рисунок 3. Одномерный SDS-PAGE стекловидного Элементы органа. Общие концентрации белка для передних гиалоидная, стекловидное базы, витreous ядро, и стекловидного коры 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 мг / мл, соответственно. Гель-электрофорез проводили при 200 кВ в течение 45 минут, окрашивали Фламинго (Bio-Rad), а также визуализировать использованием VersaDoc Система визуализации (Bio-Rad). Профили для различных тканей показать несколько подобных групп, указывающие либо сохраняется или перекрестного загрязнения белков, а также уникальные полос (звездочка), что указывает на дифференциально локализованы белки.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Azimzadeh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Стекловидное тело полупрозрачный гель которой молекулярный состав мало изучен, особенно на уровне ее подструктур: стеклообразное базу, ядро, кору, и передней гиалоидная. Стекловидное ядро содержит коллагены II, V, IX, XI и, наряду с хондроитин сульфат протеогликаны, протеогликанов гепаран сульфата и гиалуроновой кислотой. 1,2 белка биомаркеров в стекловидное ядро были связаны с такими заболеваниями, как диабетическая ретинопатия. 3-5 Как эти белки разному экспрессируются в каждой из подструктур, а во многих случаях конкретные идентичности белка, не известны. Эти данные могут дать представление о происхождении белков, связанных с конкретными заболеваниями витреоретинальной и помочь терапии целевой будущем. Хотя оптимальная после смерти интервал для ткани вскрытия не было определено, деградации белка может повлиять вниз по течению экспериментов. Например, иммуногистохимического оказывает влияние в 12-часовом глаза вскрытие и некоторых конкретных мероприятий фермента может быть уменьшен в течение нескольких часов (неопубликованные наблюдения). Все ткани в этом исследовании были собраны от 2 до 8 часов после смерти без существенного изменения в экспрессии белка или пригодности для протеомики analsyis. Жидкого азота методом замораживания сохранения выбирается по фиксации, чтобы предотвратить небольшие изменения в структуре белка вызванных фиксатором сшивки, которая была продемонстрирована в других тканях LC-MS/MS 6. Протеомных исследований будет зависеть от способности точно анализировать различные отделы стекловидного тела, как показано в этом видео эксперимента. Мы протестировали вскрытие технологии с использованием 1-мерных SDS-PAGE. Как наши результаты показывают, Есть разному экспрессируются белков в различных подструктур тела стекловидного тела. Выявление этих белков обеспечит более детального понимания стекловидного раздробленности.

<table border="1"><tbody><tr><td> Имя </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td></tr><tr><td> 0,12 щипцы </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1502 </td></tr><tr><td> 5-мл шприц </td><td> Becton Dickinson- </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Прямо Туалетный Пинцет с зубцами </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1400 </td></tr><tr><td> 23 иглы </td><td> Becton Dickinson- </td><td> 305145 </td></tr><tr><td> Колибри щипцы </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td></tr><tr><td> Кастровьехо угловой роговицы ножницы </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3223 </td></tr><tr><td> Vannas изогнутые ножницы капсулотомии </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3387 </td></tr><tr><td> Weck-Cel хирургических копья </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td></tr><tr><td> Уэсткотт изогнутые ножницы тенотомии </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3320 </td></tr></tbody></table>

Препарирование прав Стекловидное Элементы орган для анализа протеомных

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

Стекловидного является оптически прозрачные, коллагеновых внеклеточного матрикса, которая заполняет внутри глаза и перекрывает сетчатки. 1,2 Аномальные взаимодействия между стекловидного подструктур и сетчатки лежат в основе нескольких витреоретинальной заболеваний, в том числе сетчатки слезу и отряд, макулярной морщиться, макулярного отверстия, Возрастная дегенерация желтого пятна, vitreomacular тяги, пролиферативная витреоретинопатия, пролиферативная диабетическая ретинопатия, и унаследовал vitreoretinopathies. 1,2 молекулярного состава стекловидного подструктур, не известно. Так как стекловидное тело прозрачное с ограниченными хирургического доступа, было трудно, чтобы изучить его подструктур на молекулярном уровне. Мы разработали метод для разделения и сохранения этих тканей для протеомных и биохимического анализа. Рассечение технику в это экспериментальное видео показывает, как изолировать стекловидного базы, передняя гиалоидная, стекловидное ядро, кору и стекловидного тела от посмертных человеческих глаз. Одномерный SDS-PAGE анализ каждого компонента стекловидного показал, что наша техника рассечение в результате четырех уникальных профилей белка, соответствующие каждой подструктуры человеческого организма стекловидное тело. Идентификация дифференциально разобщенным белков покажет кандидата молекул основного различных витреоретинальной заболеваний.

Это видео показывает эффективную технику для дифференциации и рассекает различные полупрозрачные структуры стекловидного тела человека после смерти в глаза.

Стекловидное тело представляет собой оптически прозрачный коллагеновый внеклеточный матрикс, который заполняет внутреннюю полость глаза и перекрывает сетчатку. 1,2 Аномальные взаимодействия...

Стекловидное тело представляет собой оптически прозрачный внеклеточный матрикс, заполняющий внутреннюю полость глаза. Его можно разделить на несколько субструктур, включая переднюю гиалоидную мембрану за хрусталиком, основание стекловидного тела у передней части сетчатки, кортекс стекловидного тела, образующий эластичную оболочку, и ядро стекловидного тела в центре. Для препарирования стекловидного тела сначала необходимо удалить передний сегмент.Для разреза роговицы в области лимба используется сверхзаточенное лезвие. Затем с помощью роговично-склеральных ножниц роговицу рассекают непосредственно перед лимбом. Радужку отделяют изогнутыми ножницами, осторожно оттягивая ее от поверхности.Слегка надавив на глазное яблоко, можно выдавить хрусталик. Чтобы удалить стекловидное тело, используйте иглу 23G на шприце объемом 5 cc и аспирируйте практически жидкое стекловидное тело. Передняя гиалоидная мембрана становится видна как тонкая прозрачная мембранная структура, которую можно захватить пинцетом.Это эластичная структура, расположенная сразу за хрусталиком. Внутренний круг представляет собой связку Витта. Для рассечения стекловидного тела используют ножницы Ван, в то время как пинцетом создают тяжение.Ткань латеральной области можно перенести в пробирку AFU и повторять эту манипуляцию до полного препарирования всей ткани. Для доступа к оставшимся субструктурам стекловидного тела необходимо вскрыть глаз с помощью изогнутых ножниц Westcott. Каждый из лоскутов отводят пинцетом в чашку Петри.На данном изображении представлена анатомия основания стекловидного тела — тонкой прозрачной ткани, которая охватывает ora serrata. Ora serrata является разделительной линией между цилиарным телом спереди и сетчаткой сзади. В отличие от других частей стекловидного тела, его основание плотно прилегает к подлежащему цилиарному телу и сетчатке, поэтому при натяжении пинцетом эта ткань фактически приподнимается.Для изолирования основания стекловидного тела сначала удаляют плоскую часть цилиарного тела (pars plana) с помощью пинцета и ножниц Вескотта. Pars plana представляет собой этот небольшой участок с гребнями. Затем, чтобы изолировать основание стекловидного тела, сделайте разрез на два-три миллиметра кзади от ora serrata ножницами Вескотта, стабилизировав глаз пинцетом; зафиксируйте основание стекловидного тела пинцетом, создавая натяжение, и последовательно прорежьте его ножницами Вескотта.При иссечении основания стекловидного тела наблюдается картина в виде «нитки жемчуга», что позволяет увидеть, как этот внеклеточный матрикс может компартментизировать белки. Для диссекции оболочки стекловидного тела можно использовать различные методики. Контакт с губкой для клеток WEX позволит приподнять кору.Край кортекса можно обнаружить между листками, как показано здесь. Снова используйте пинцет для создания натяжения и ножницы Ван Несса (VanNess), чтобы последовательно иссечь витреальный кортекс. Кортекс также можно приподнять над диском; в данном случае используются более крупные ножницы Весткот (Westcott) для диссекции кортекса по мере его осторожного отделения от поверхности сетчатки.Затем образцы можно поместить в микроцентрифужную пробирку и хранить для последующего протеомного анализа.

dissection-of-human-vitreous-body-elements-for-proteomic-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

Медицина

Не-человеческое приматов является важным поступательное видов для нашего понимания развития и старения. Анатомическая организация приматов сетчатки может предоставить важную информацию о нормальных и патологических состояний у человека.

Ворота в мозг: Пройдя Предстоятель глаз

Рассечение техника иллюстрирует потрошения стекловидного тела, сетчатки и объектив от мыши глаз, разделение центрифугированием, и характеристика с белком анализов.

Evisceration стекловидного тела и сетчатки мышь для протеомных Анализы

Нейронные сетчатки мыши в возрасте 8 дней на вершине 4% желатина блока. После выделения фоторецепторов слоя (200 мкм) по vibratome, фоторецепторы высевают после механической и ферментативной диссоциации культуры. Фоторецептор слой может быть использован для молекулярных, биохимических анализов или трансплантации.

Vibratome секционирования мыши Retina Подготовка фоторецептора культур

Цель этого протокола - показать эффективную технику выделения целого, неповрежденного ядра стекловидного тела и коры из посмертно энуклеированных свиных глаз.

Всего Стекловидное тело Рассечение для Vitreodynamic анализа

Человека Сетчатка состоит из функционально и молекулярно различных регионов, включая фовеа, макулы и периферийных сетчатки. Здесь мы описываем метод, с помощью биопсии удара и ручного удаления слоев ткани от человеческого глаза вскрыть и собирать эти собственный сетчатки регионов для вниз по течению протеомного анализа.

Диссекции человека сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа

Характеристика протеома глазной микрососудистой кровати имеет решающее значение для глубокого понимания многих глазной патологии в организме человека. Это исследование показывает, эффективный, быстрый и надежный метод для извлечения белков и подготовки проб из мелких кровеносных сосудов, используя свинину короткие задней цилиарной артерии как модель судов для масс спектрометрии основе протеомики анализов.

Пробоподготовки для анализа на основе масс спектрометрии Proteomics глазной микрососудов

Описан метод эффективного отделения пигментного эпителия сетчатки (RPE) от сетчатки в глазах человека и генерации целых RPE/хориоидных плоских маунтов для гистологического и морфометрического анализа RPE.

Эффективная и последовательная генерация пигментных эпителиев сетчатки / плоских гор сосудистой оболочки из глаз человека для гистологического анализа

Этот протокол представляет собой интегрированную платформу биорепозитория для стандартизированного сбора, аннотации и биобанкирования высококачественной водянистой влаги человека и биопсии стекловидного тела для последующего молекулярного анализа, включая протеомику, метаболомику и гликомику.

Биобанкинг биопсии водной и стекловидной жидкости человека для молекулярных анализов

Сетчатка демонстрирует сложную пространственную организацию по всей своей ламинарной структуре. Современные методы пространственной транскриптомики и секвенирования требуют срезов тканей толщиной &lt; 20 мкм, что ограничивает их применимость в исследованиях сетчатки. Этот метод криосекции позволяет получить тонкие срезы сетчатки мыши, сохраняя при этом плоские пространственные отношения, что позволяет проводить всестороннее молекулярное картирование пластинок.

В лицо Криосекция сетчатки мыши для многомерного пространственного молекулярного анализа

Этот метод визуализирует нативную структуру коллагеновых волокон в стекловидном теле с помощью конфокальной отражательной микроскопии.

Подготовка свиных глаз к конфокальной отражательной микроскопии для визуализации сети коллагеновых волокон стекловидного тела

Узнайте методику диссекции стекловидного тела человека для протеомного анализа. Демонстрируется выделение передней гиалоидной мембраны, базы и коры стекловидного тела с помощью прецизионных инструментов.

Препарирование прав Стекловидное Элементы орган для анализа протеомных

Больше видео