Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample
JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 3:32 мин • July 1st, 2026
Take a soil extract containing bacteriophages, including Arthrobacter phages, pre-mixed with a growth medium.
Add Arthrobacter bacteria and incubate under agitation.
Arthrobacter phages attach to the bacterial surface and inject their DNA to produce new phages.
The host cells lyse to release progeny phages, enriching the medium with Arthrobacter phages.
Dilute this medium to reduce the phage concentration.
Add fresh Arthrobacter cells and calcium ions, which aid in phage infection.
Mix with a soft agar and pour onto a nutrient agar plate. The solidifying soft agar immobilizes the bacteria and restricts the phage spread.
Upon incubation, each phage infects a nearby host cell. It then produces progeny phages that infect neighboring bacteria, allowing localized infection.
The uninfected bacterial cells grow, while the infected bacterial cells lyse, detected as clear zones called plaques over a bacterial lawn.
These plaques contain progeny phages, ready for downstream use.
Begin this procedure by adding 1 to 2.5 milliliters of late exponential or early stationary phase bacteria culture to each of the flasks containing filter sterilized LB soil extract mixture. If the OD 600 of the culture is 0.5 to 0.7, use 1 milliliter. If the OD600 is higher than 0.7, use 2.5 milliliters.
Shake the flasks at 250 RPM at 30 degrees Celsius for approximately 24 hours in a shaking incubator. After the 24 hour incubation period, remove the enrichment flasks from the shaking incubator. Dilute the enrichment samples tenfold in phage buffer.
Set up culture tubes with 0.5 milliliters of late exponential or early stationary phase bacteria culture. Add various amounts from 5 microliters to 500 microliters of the diluted enrichment culture to the culture tubes.
Add calcium chloride to the culture tubes to make a final concentration in 5 milliliters equal to the concentration present in the original enrichment flask. Use a range of different calcium chloride concentrations to select for many phages with varying calcium chloride dependencies. Add 4.5 milliliters of LB top agar to each culture tube, and pour the mixture onto an LB agar plate.
Swirl gently to distribute evenly across the plate and allow the top agar to solidify for approximately 15 minutes. Invert the plates and incubate at 30 degrees Celsius overnight to 48 hours. Vary the incubation times to optimize for the phages present.
Обзор
В данной статье представлен оптимизированный метод обогащения для выделения видов бактериофагов Arthrobacter из образцов почвы. Протокол сочетает в себе методы использования обогащенных культур и анализ по методу бляшек для амплификации, обнаружения и выделения фагов, которые визуализируются в виде четких зон лизиса на бактериальном газоне.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Исследования бактериофагов
- Экологическая вирология
Теоретические сведения
- Бактериофаги — это вирусы, которые заражают бактерии и играют ключевую роль в микробной экологии.
- Виды Arthrobacter являются распространенными почвенными бактериями и имеют важное значение для экологических исследований.
- Изоляция фагов из образцов окружающей среды требует эффективных методов обогащения и детекции.
- Метод агаровых слоев (метод бляшек) является стандартным способом визуализации и количественной оценки активности фагов.
Цель исследования
- Оптимизировать обогащение и выделение фагов Arthrobacter из образцов почвы.
- Продемонстрировать воспроизводимый протокол амплификации и обнаружения фагов с помощью метода агаровых слоев (подушечного метода).
- Обеспечить возможность последующего использования выделенных фагов в прикладных целях.
Используемые методы
- Приготовление почвенного экстракта, содержащего бактериофаги, и его смешивание с питательной средой.
- Добавление бактерий Arthrobacter и инкубация при перемешивании при 30°C в течение 24 часов.
- Разбавление обогащенной среды и добавление свежих бактериальных клеток и хлорида кальция.
- Смешивание с мягким агаром и посев на чашки с питательным агаром для проведения метода агаровых слоев (плак-теста).
- Инкубация чашек для обеспечения инфицирования фагами и формирования плак.
Основные результаты
- Успешное обогащение и амплификация фагов Arthrobacter из образцов почвы.
- Образование четких бляшек на бактериальных газонах, свидетельствующее о локализованном фаг-индуцированном лизисе.
- Оптимизация концентрации хлорида кальция для отбора фагов с различной степенью зависимости от него.
- Изоляция дочерних фагов из бляшек для дальнейшего изучения.
Выводы
- Оптимизированный протокол обогащения и анализа бляшек позволяет эффективно изолировать фаги Arthrobacter из почвы.
- Регулирование плотности бактериальной культуры и концентрации хлорида кальция повышает эффективность выделения фагов.
- Данный метод может быть использован в последующих исследованиях в области биологии фагов и экологической микробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эффективное выделение бактериофагов Arthrobacter из образцов окружающей среды позволяет создавать надежные биологические инструменты для микробиологических исследований и биотехнологического применения. Рабочий процесс обогащения и анализа по методу бляшек обеспечивает воспроизводимую основу для создания хорошо охарактеризованных стоков фагов, что способствует раннему поиску и разработке методов анализа в биофармацевтических исследованиях и разработках. Данная возможность имеет решающее значение для развития технологий на основе бактериофагов и снижения рисков при валидации микробных мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Позволяет исследовать взаимодействия между бактериофагом и хозяином для валидации микробных мишеней.
- Обеспечивает биологическое снижение рисков путем выделения фагов с определенной специфичностью к хозяину.
- Повышает прогностическую достоверность последующих исследований биологии фагов.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создавать валидированные запасы фагов для стандартизированного анализа бляшек.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные данные по количеству бляшек для оптимизации анализа.
- Поддерживает масштабируемые рабочие процессы для скрининга взаимодействий фагов и бактерий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает преемственность этапов от выделения фагов из окружающей среды до разработки доклинических моделей, если это применимо.
- Поддерживает продвижение кандидатов-фагов для дальнейшей характеризации с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применяется на этапе перехода от начального поиска к разработке анализа, обеспечивая создание базовых запасов фагов и получение количественных данных для последующего скрининга и изучения механизмов действия.
- Открывательная биология: обеспечивает проверку гипотез о специфичности фагов к хозяину и динамике инфекции.
- Скрининг: позволяет проводить воспроизводимые тесты на образование бляшек для сравнительной оценки активности фагов.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение зон лизиса для сравнения инфекционности фагов.
- Трансляционные исследования: создает основу для перевода перспективных фагов на стадию доклинической оценки при наличии дополнительных данных.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный протокол для многократного выделения и характеристики фагов из окружающей среды.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность при выборе фагов и валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы обогащения и анализа бляшек для обеспечения воспроизводимости.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей работы с кандидатами-фагами.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию исследовательских инициатив на основе фагов с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области микробиологии и биологии фагов.
- Необходим доступ к встряхивающим инкубаторам, спектрофотометрам и инфраструктуре для работы в стерильных условиях.
- Требуется стандартизация условий метода агаровых слоев (plaque assay) между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости.
- Может потребоваться адаптация параметров обогащения для различных образцов из окружающей среды или бактериальных хозяев.
- Результат зависит от оптимизации концентраций хлорида кальция и времени инкубации для максимального восстановления фагов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Понимание влияния умеренных бактериофагов на их лизогены с помощью транскриптомики
Похожие видео
0 Просмотры
Взаимодействие бактериофага Т4 и кишечной палочки в кишечнике мышей: прототипная модель для изучения динамики бактериофагов хозяина in vivo
Похожие видео
0 Просмотры
Удаление бактериофагов из инфицированных культур сальмонеллы
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение устойчивых к антибиотикам бактерий из пробы воды для молекулярного анализа
Похожие видео
0 Просмотры
Подготовка бактериальной культуры почвы для инфекции бактериофагами
Похожие видео
0 Просмотры
Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample
Похожие видео
0 Просмотры
Оптимизированная Техника по обогащению для изоляции
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение культурных дрожжей и плесени из почв для исследования структуры грибковой популяции
Похожие видео
0 Просмотры
Биоразведка экстремофильных микроорганизмов для борьбы с загрязнением окружающей среды
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и идентификация бактерий, устойчивых к антибиотикам, передающихся через воду, и молекулярная характеристика их генов устойчивости к антибиотикам
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026